張 龍， 司海明， 倪 曄

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

響應面法優(yōu)化重組大腸桿菌產(chǎn)ADI酶發(fā)酵培養(yǎng)基

張 龍， 司海明， 倪 曄*

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

在單因素優(yōu)化的基礎上，采用響應面分析方法對重組大腸桿菌生產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶（ADI）的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。借助于SAS軟件，結(jié)合Plackett-Burman和Box-Behnken實驗設計對5種培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基組分為胰蛋白胨11.16 g/L，酵母提取物20 g/L，甘油6.3 g/L，磷酸氫二鉀16.38 g/L，磷酸二氫鉀2.31 g/L。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，ADI酶活達到5.7 U/mL發(fā)酵液，比初始培養(yǎng)基（3.72 U/mL發(fā)酵液）提高了1.53倍，比LB培養(yǎng)基（2.83 U/mL發(fā)酵液）提高了2.01倍。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基在3 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，ADI酶活達到15.17 U/mL發(fā)酵液，較LB培養(yǎng)基（4.32 U/mL發(fā)酵液）提高了3.51倍。

大腸桿菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；ADI酶活；響應面

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是世界第五大常見惡性腫瘤，死亡率極高，肝癌晚期病人平均存活率僅為1～4個月[1-2]。由于化療效果較差，目前迫切的需要另一種有效的治療方法。肝癌細胞是精氨酸營養(yǎng)缺陷型細胞，由于缺少精氨琥珀酸合成酶（Arginine succinate synthetase，ASS）必須從環(huán)境中獲取精氨酸以供生長[3-4]。精氨酸脫亞胺酶（Arginine deiminase，ADI，EC3.5.3.6）能將L-精氨酸不可逆地水解為L-瓜氨酸和氨，從而切斷腫瘤細胞的精氨酸供給，來達到消滅或抑制腫瘤細胞生長的作用，而正常細胞可以自身合成精氨酸不受影響[3，5，8]。這種“精氨酸剝奪療法”治療精氨酸營養(yǎng)缺陷型癌癥具有廣泛的研究前景。近年來，PEG化修飾重組ADI以其良好的療效和較低的副作用已得到了廣泛關注，美國鳳凰公司研發(fā)的ADI-PEG-20針對治療肝癌臨床試驗已經(jīng)進行至第Ⅲ期[6-7]。除了肝細胞癌外，ADI還可以用于治療黑素瘤、白血病、乳腺癌和胃癌等疾病[9-12]。

ADI廣泛存在于細菌、古細菌和真核細胞中，自從 1933年 F.Horn首次報道了綠膿假單胞菌（Bacillus pyocyaneus）中含有ADI后[13]，之后很多來源于不同微生物的ADI相繼被報道，其中包括假單胞菌[8，14-16]、支原體[5，17]、鹽桿菌[18]和乳球菌[19]等。 不同微生物來源的ADI在酶活及性質(zhì)方面也有所不同，比酶活范圍從5.4～140.3 U/mg，最適反應pH 5.6～7.6。

作者所在研究室前期從自然界篩選得到一株產(chǎn) ADI的 變 形 假 單 胞 菌 （Pseudomonas plecoglossicida）[8]，通過對其進行蛋白質(zhì)工程改造，獲得了一株在生理中性pH下具有高比酶活和改良酶學性質(zhì)的ADI優(yōu)勢突變株M13-3[20-21]。大腸桿菌通常采用LB培養(yǎng)基進行發(fā)酵，但是LB培養(yǎng)基往往發(fā)酵效率低，成本高，不適合大規(guī)模培養(yǎng)。作者對實驗室前期構(gòu)建的重組表達ADI突變株M13-3的大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以LB培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基，在單因素優(yōu)化實驗的基礎上，對確定的5種培養(yǎng)基組分使用響應面方法 （Response Surface Methodology，RSM）進行優(yōu)化，采用多元二次回歸方程擬合實驗因子（培養(yǎng)基組分的濃度）與響應值（每毫升發(fā)酵液中ADI酶活）的關系，分析各組分的最優(yōu)濃度，進一步提高發(fā)酵液中ADI酶活[22-25]。

1 材料與方法

1.1 菌種

基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET24a-adi菌株：作者所在實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。經(jīng)過單因素優(yōu)化實驗，確定初始發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：胰蛋白胨16 g/L，酵母提取物20 g/ L，甘油10 g/L，磷酸氫二鉀12.54 g/L，磷酸二氫鉀2.31 g/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌種活化將菌種甘油管接種于30 mL LB培養(yǎng)基中，37℃活化10 h。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)方法將經(jīng)過活化的菌液按4%的轉(zhuǎn)接體積分數(shù)加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)，當菌濃OD600達到0.6～0.8時，加入終濃度0.2 mmol/L的IPTG進行誘導，轉(zhuǎn)速為200 r/min，30℃培養(yǎng)6 h。

1.3.3 3 L發(fā)酵罐發(fā)酵將活化種齡為6 h的菌液按2%的體積分數(shù)接入3 L發(fā)酵罐中，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量為4 vvm，37℃下培養(yǎng)至菌株生長對數(shù)初期，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG并在30℃下發(fā)酵。

1.4 ADI酶活測定

ADI酶活測定：采用作者所在研究室建立的改良的二乙酰一肟-硫胺脲法[20]。酶活力單位定義：37℃條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol精氨酸鹽酸鹽生成瓜氨酸所需的酶量定義為1 U。

1.5 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman（PB）設計法是一種基于各因子兩水平的試驗設計方法，通過比較因子間兩水平的差異和整體的差異來確定因子的顯著性。根據(jù)文獻及實驗的實際情況，采用SAS軟件設計實驗次數(shù)N=12的實驗方案，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基的5種因子進行考察，每個因子取兩水平，低水平為初始值，高水平為低水平的1.5倍，響應值為每毫升發(fā)酵液中ADI的酶活（三組平行實驗均值）。

1.6 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗得出的結(jié)果，可以確定顯著因子的爬坡方向，設計N=6的爬坡實驗，確定響應面實驗的中心點，即0水平值。

1.7Box-Behnken試驗

以胰蛋白胨、甘油、磷酸氫二鉀3個因子為自變量，以實驗中心點確定三因子的三個水平，即-1，0，1水平值。以ADI酶活為響應值，采用Box-Behnken（BBD）設計并與響應面分析相結(jié)合，來探索培養(yǎng)基中關鍵因素的最優(yōu)質(zhì)量濃度。共有15個實驗點，其中析因點12個，中心點3個，每組實驗重復3次。

1.8 模型擬合與驗證

對BBD試驗所獲得的實驗數(shù)據(jù)與響應面模型進行擬合分析，確定回歸方程的極值點及相應的自變量取值，并進行搖瓶驗證實驗，重復3次。根據(jù)搖瓶驗證結(jié)果進行3 L發(fā)酵罐放大驗證實驗，驗證模型的可靠性，最終確定優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計篩選重要實驗因子

在單因素優(yōu)化實驗結(jié)果的基礎上，對培養(yǎng)基的5種組分進行PB重要性篩選，使用SAS軟件設計12組實驗，每組同時做3個平行實驗，取ADI酶活的平均值作為響應值，實驗設計與響應值結(jié)果見表1。顯著性分析、因素水平取值及方差分析見表2。

根據(jù)表2的結(jié)果，根據(jù)統(tǒng)計學原理分析響應值及其回歸方程系數(shù)，分析顯著性結(jié)果，顯示胰蛋白胨（X1）、甘油（X3）和磷酸氫二鉀（X5）這三種成分是影響ADI酶活的主要因素（Prob＞F值＜0.05），同時模型方差分析的可信度R2=0.974 3，證明該模型顯著性極高。

表1 Plackett-Burman試驗因素設計及響應值Table 1 Experimental design and response values of Plackett-Burman（N=12）

表2 Plackett-Burman實驗因素水平及方差分析Table 2 Range of values of Plackett-Burman and ANOVA

由表2中t檢驗值的大小得出，胰蛋白胨和甘油對ADI酶活具有負效應，而磷酸氫二鉀具有正效應，并對胰蛋白胨、甘油、磷酸氫二鉀三個因素進行下一步實驗。

2.2 最陡爬坡試驗

對PB試驗結(jié)果確定的三種顯著性實驗因素進行爬坡實驗，使其濃度盡量靠近最佳水平值區(qū)域，從而增加響應面試驗的準確性與顯著性。最陡爬坡試驗以各試驗因子低水平值為起點，以效應水平作為爬坡方向，由于胰蛋白胨和甘油負效應明顯，質(zhì)量濃度應相應降低；磷酸氫二鉀響應值為正，質(zhì)量濃度應該增加。根據(jù)這三個因素效應的大小決定其變化步長及方向，以其低水平為各自起點，其他變量也同時取相應低水平，實驗設計及結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡試驗設計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of steepest ascent

由結(jié)果可見，酶活最高值在第3組與第4組實驗之間，并且第4組的產(chǎn)量較之更高，所以作者以第4組的條件作為最佳因素質(zhì)量濃度的組合并作為下一步中響應面試驗的中心點，即胰蛋白胨10 g/L、甘油4 g/L、磷酸氫二鉀16.73 g/L。

根據(jù)上述結(jié)果，確定三種實驗因素的三水平值，實驗標號及水平值見表4。

2.3 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果分析

Box-Behnken是基于三水平的二階試驗設計，是較為優(yōu)化的中心組合設計方法，與其他方法相比，實驗次數(shù)較少，效率較高。根據(jù)BBD的中心組合設計并與響應面分析相結(jié)合，以發(fā)酵液中ADI酶活為響應值，設計15組實驗來進一步優(yōu)化胰蛋白胨、甘油、磷酸氫二鉀這三個顯著因素的質(zhì)量濃度，培養(yǎng)基其他組分質(zhì)量濃度與初始培養(yǎng)基相同。15組實驗中，12組為析因點實驗，3組為中心點實驗，每組均做3個平行實驗，結(jié)果取平均值，實驗設計及結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken實驗因素及水平

Table 4 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

變量 編碼符號水平-1 0胰蛋白胨質(zhì)量濃度/(g/L) 8 X1 10 12甘油質(zhì)量濃度/(g/L) X2 2 4 +1 X3磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度/(g/L) 15.68 16.73 6 17.77

使用SAS軟件對BBD設計的實驗結(jié)果進行方差分析及多元二階模型擬合，方差分析結(jié)果見表6。結(jié)果表明，F(xiàn)值（5.05）反應了總模型方程具有較顯著的效應，復相關系數(shù)R2值是0.901，說明實驗數(shù)據(jù)對于實驗模型擁有很高的擬合程度，變異系數(shù)CV值為7.49，證明該方程真實反應了實驗數(shù)據(jù)。對實驗模型進行二階回歸擬合，得到回歸方程為：

表5 Box-Behnken實驗設計及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken

表6 回歸方程分析Table 6 Analysis of variance（ANOVA）for the quadratic model

根據(jù)上述回歸分析結(jié)果繪制相應三維曲面圖，見圖1～圖3。作為確定各因素最優(yōu)濃度的依據(jù)也可以直觀地看出兩種試驗因子的相互作用關系。在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，三種試驗因子之間并沒有明顯的相互關系，從表6的交互項顯著性值（prob＞F值＞0.1）也可得知。但是模型存在最優(yōu)的極值條件，即在相應曲面的最高點處。

對回歸方程求解，分別求出極值點為X1=0.578 6，X2=1.153 1，X3=-0.330 5，對應的實驗組分質(zhì)量濃度為胰蛋白胨11.157 2 g/L，甘油6.306 2 g/L，磷酸氫二鉀16.379 6 g/L，預測最大酶活可以達到6.14 U/mL發(fā)酵液。

圖1 ADI酶活與胰蛋白胨（X1）和甘油（X2）的關系（X3=0）Fig.1 Response surface plot of the combined effect of tryptone（X1）and glycerol（X2）on ADI activity（Y）

圖2 ADI酶活與胰蛋白胨（X1）和磷酸氫二鉀（X3）的關系（X2=0）Fig.2 Response surface plot of the combined effect of tryptone（X1）and K2HPO4（X3）on ADI activity（Y）

2.4 驗證實驗

以實驗因子的最優(yōu)質(zhì)量濃度對模型進行驗證實驗，最優(yōu)培養(yǎng)基組分為胰蛋白胨11.16 g/L，酵母提取物20 g/L，甘油6.3 g/L，磷酸氫二鉀16.38 g/L，磷酸二氫鉀2.31 g/L。結(jié)果表明，優(yōu)化后培養(yǎng)基經(jīng)搖瓶發(fā)酵，ADI酶活達到5.7 U/mL發(fā)酵液，比初始培養(yǎng)基（3.72 U/mL發(fā)酵液）提高了1.53倍，比LB培養(yǎng)基（2.83 U/mL發(fā)酵液）提高了2.01倍。對比模型預測最大響應值即ADI酶活為6.14 U/mL發(fā)酵液，故預測值與實際值的誤差是-5.7%。該結(jié)果表明，經(jīng)過響應面設計優(yōu)化后的產(chǎn)ADI的最優(yōu)培養(yǎng)基是有效可行的。

圖3 ADI酶活與甘油（X2）和磷酸氫二鉀（X3）的關系（X1=0）Fig.3 Response surface plot of the combined effect of glycerol（X2）and K2HPO4（X3）on ADI activity（Y）

根據(jù)搖瓶驗證實驗的結(jié)果進行3 L發(fā)酵罐驗證實驗，進一步驗證模型的可靠性。發(fā)酵10 h后，LB培養(yǎng)基中ADI酶活達到最大值，為4.32 U/mL發(fā)酵液；而采用優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵10 h后，ADI酶活最大值為15.17 U/mL發(fā)酵液，提高了3.51倍，見圖4。

圖4 3 L發(fā)酵罐中采用RSM優(yōu)化后培養(yǎng)基（a）和LB培養(yǎng)基（b）發(fā)酵產(chǎn)重組ADI的時間進程曲線Fig.4 Comparison of recombinant ADI fermentation using RSM optimized medium （a）and LB medium（b）

3 結(jié)語

通過PB試驗篩選顯著影響因子，并結(jié)合響應面試驗分析，確定了重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)ADI酶的最佳培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨11.16 g/L，酵母提取物20 g/L，甘油6.3 g/L，磷酸氫二鉀16.38 g/L，磷酸二氫鉀2.31 g/L。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)ADI的酶活達到5.7 U/mL發(fā)酵液，比初始培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵分別提高了1.53倍和2.01倍；而在3 L發(fā)酵罐中的ADI酶活進一步提高到15.17 U/mL發(fā)酵液。本研究結(jié)果證明：采用響應面方法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化以提高重組大腸桿菌產(chǎn)ADI酶是有效可行的。

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Fermentation Medium Optimization for Arginine Deiminase Production from Recombinant Escherichia coli by Response Surface Methodology

ZHANG Long， SI Haiming， NI Ye*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Response surface methodology was used to optimize the fermentation medium of recombinant E.coli for arginine deiminase production on the basis of single factor optimization. Five medium factors were optimized by SAS software combined with Plackett-Burman and Box-Behnken design.The optimized fermentation medium contains 11.16 g/L tryptone，20 g/L yeast extract，6.3 g/L glycerol，16.38 g/L K2HPO4，and 2.31 g/L KH2PO4.Using the optimized medium，the activity of ADI reached 5.7 U/mL broth，which was 1.53-fold higher than that of in the initial medium （3.72 U/mL）and 2.01-fold of that in LB medium （2.83 U/mL）.In a 3-L bioreactor，ADI activity of 15.17 U/mL broth was attained using optimized medium，which was remarkably enhanced compared with that of LB medium（4.32 U/mL）.

Escherichia coli，medium optimization，arginine deiminase，response surface

TQ 920.1

A

1673—1689（2015）05—0475—07

2014-02-27

國家自然科學基金項目（30900030；21276112）；國家973計劃項目 （2011CB710800）；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目（NCET-11-0658）。

*通信作者：倪 曄（1975—），女，江蘇無錫人，工學博士，教授，碩士研究生導師，主要從事生物催化和酶工程等方面的研究。

E-mail：yni@jiangnan.edu.cn