桑尚源， 光翠娥， 江 波

（食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫214122）

人體腸道菌群對(duì)大豆皂苷Ⅱ的體外代謝轉(zhuǎn)化

桑尚源， 光翠娥*， 江 波

（食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫214122）

為考察人體腸道菌群對(duì)大豆皂苷Ⅱ的體外代謝轉(zhuǎn)化作用，在牛腦牛心培養(yǎng)液（BHI）和磷酸鹽緩沖液（PBS）兩種離體模型下，研究了大豆皂苷Ⅱ在48 h內(nèi)被腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程，并用HPLC/MS系統(tǒng)對(duì)其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果顯示，大豆皂苷Ⅱ先被菌群酶轉(zhuǎn)化為大豆皂苷Ⅳ，在48 h被最終轉(zhuǎn)化為大豆皂苷元B，表明大豆皂苷在腸道微生物作用下，其糖基被逐步水解生成相對(duì)分子質(zhì)量更小、疏水性更強(qiáng)的代謝物。

大豆皂苷Ⅱ；大豆皂苷元B；腸道菌群；高效液相；質(zhì)譜

大豆皂苷是主要存在于豆科植物中的一類(lèi)三萜烯葡萄糖苷，在大豆和豆制品中約為0.5～114 μmol/g[1]。根據(jù)其苷元及其連接的糖鏈結(jié)構(gòu)特征，大豆皂苷分為A組、B組、E組和DDMP組。大豆皂苷具有降血脂[2]、降血壓[3]、抗病毒、保肝、抗腫瘤、抗炎抗過(guò)敏等藥理作用[4]，有巨大的開(kāi)發(fā)前景。這些大豆皂苷的藥理活性功能可能是經(jīng)腸道菌代謝后所得的活性代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液發(fā)揮其療效[5]。Hu和Chang兩人均已報(bào)道，在離體實(shí)驗(yàn)下大豆皂苷Ⅰ會(huì)被腸道微生物脫糖降解，代謝產(chǎn)物為大豆皂苷Ⅲ和大豆皂苷元B[6-7]。2010年，Chang等人報(bào)道了人腸道菌群在離體實(shí)驗(yàn)下對(duì)大豆皂苷Ab的代謝途徑[8]。

作為一種具有代表性的皂苷，大豆皂苷Ⅱ是豆制品中皂苷的主要存在形式之一[1]，其與大豆皂苷Ⅰ同屬B組，見(jiàn)圖1[3]。大豆皂苷Ⅱ具有多種生物活性，如抑制人體腎素活性[3]、抗皰疹病毒（HSV-1）[9]和作為免疫佐劑[10]。為探究大豆皂苷在體內(nèi)的生物利用度和轉(zhuǎn)化代謝產(chǎn)物以及代謝產(chǎn)物和生理活性之間的聯(lián)系，作者研究了在體外模型中，人腸道菌群是否對(duì)大豆皂苷Ⅱ進(jìn)行相似脫糖降解的代謝轉(zhuǎn)化作用，并且使用HPLC/MS系統(tǒng)對(duì)代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行初步的分析鑒定。

圖1 大豆皂苷Ⅰ、Ⅱ和大豆皂苷元B的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of soyasaponinsⅠandⅡand soyasapogenol B

1.1 材料與儀器

大豆皂苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品 （AS，純度 91.7%）：ChromaDex公司；碳酸鈉、乙醇、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲酸：色譜純，Merck公司；BHI培養(yǎng)基（組分g/L）：牛腦浸粉12.5，牛心浸粉5，葡萄糖2，蛋白胨10，氯化鈉5，十二水合磷酸氫二鈉6.3，碳酸鈉4，半胱氨酸0.25；刃天青（0.1%）1 mL，pH 7.4，115℃滅菌30 min[11]。

5804R型號(hào)離心機(jī)：eppendorf公司；DG250厭氧工作站：英國(guó)Don Whiteley Science（DWS）公司；YM75壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；WATERS ACQUITY UPLC、WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS、Masslynx 4.1工作站：美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 在BHI模擬系統(tǒng)中人腸道菌群對(duì)大豆皂苷Ⅱ的降解代謝作用取青年健康志愿者新鮮糞便10 g，用100 mL滅菌后的BHI培養(yǎng)液稀釋?zhuān)?00 g離心10 min），得上層液體繼續(xù)離心（10 000 g離心15 min）得菌體，重懸，離心（10 000 g離心15 min）得到菌體，加入10 mL BHI培養(yǎng)液（滅菌后加入質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的大豆皂苷Ⅱ），密閉恒溫37℃厭氧培養(yǎng)[7]，分別于0、12、24、48 h取樣2 mL，-20℃冷凍待測(cè)。

1.2.2 在PBS模擬系統(tǒng)中人腸道菌群對(duì)大豆皂苷Ⅱ的降解催化作用菌體的獲得過(guò)程同1.2.1，所得菌體加入10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，滅菌后加入大豆皂苷Ⅱ，質(zhì)量濃度1 mg/mL）[12]，密閉恒溫37℃轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分別于0、4、8、12、24、48 h取樣1 mL，-20℃冷凍待測(cè)。

1.2.3 代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析與鑒定樣品解凍，離心，取上清液加入三倍體積75%乙醇沉淀蛋白質(zhì)，再次離心后過(guò)微孔濾膜，進(jìn)行HPLC/MS系統(tǒng)檢測(cè)。色譜條件：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸，梯度洗脫；流速為0.3 mL/min；柱溫45℃；色譜柱BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜條件：離子方式ESI+；毛細(xì)管電壓3.5 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度100℃；脫溶劑溫度400℃，流速為500 L/h；碰撞能量6 eV；質(zhì)荷比（m/z）范圍50～1 500；檢測(cè)器電壓1 800 V。數(shù)據(jù)的采集和評(píng)估使用MassLynx 4.1工作站。

2 結(jié)果與討論

2.1 人腸道菌群對(duì)大豆皂苷Ⅱ的代謝轉(zhuǎn)化結(jié)果

一般情況下，大豆皂苷在體內(nèi)的生物利用度較低，人體吸收少，在腸道內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，被腸道微生物中的糖苷酶降解，其含量逐漸降低。本實(shí)驗(yàn)在BHI和PBS兩種體外模擬系統(tǒng)下采用HPLC/MS系統(tǒng)分別對(duì)大豆皂苷Ⅱ進(jìn)行初步定量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 在兩種發(fā)酵系統(tǒng)中腸道微生物對(duì)大豆皂苷Ⅱ的體外代謝對(duì)照Fig.2 Comparison of in vitro metabolism of soyasaponinⅡin two fermentation systems

由圖2可看出，在左邊BHI系統(tǒng)中，12 h后大豆皂苷Ⅱ大部分被降解，這與Hu等人對(duì)大豆皂苷Ⅰ被腸道代謝的研究結(jié)果相類(lèi)似[6]。再由圖2右邊PBS系統(tǒng)得出，大豆皂苷Ⅱ在12 h后全部被降解，說(shuō)明腸道微生物降解皂苷的糖苷酶類(lèi)在PBS系統(tǒng)中酶活力更高，這也許是因?yàn)樵贐HI培養(yǎng)液中，微生物需要消耗其它碳源、氮源等物質(zhì)進(jìn)行各種其它代謝活動(dòng)，減少了對(duì)大豆皂苷Ⅱ的代謝活力。

2.2 在PBS模擬系統(tǒng)中人腸道微生物對(duì)大豆皂苷Ⅱ轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析與鑒定

在BHI培養(yǎng)液系統(tǒng)中，由于發(fā)酵后培養(yǎng)液成分復(fù)雜，較難分析鑒定出大豆皂苷的代謝產(chǎn)物，所以只在磷酸鹽溶液中分析其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。Zhang等人研究了在磷酸鹽溶液（PBS）中多種大豆皂苷被一種腸道益生菌Lactobacillus rhamnosus轉(zhuǎn)化降解[12]，并產(chǎn)生一種小分子的物質(zhì)。在PBS系統(tǒng)中腸道微生物對(duì)大豆皂苷Ⅱ的轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)圖3-4。

由圖3可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品大豆皂苷Ⅱ在色譜s中保留時(shí)間值（RT）為7.38 min，則0 h時(shí)樣品色譜p中RT=7.41 min的色譜鋒即確定為大豆皂苷Ⅱ。根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，大豆皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的色譜峰RT值一般比初始物大，可確定色譜a中RT=7.51 min色譜峰為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物M1，色譜b中RT=9.75 min色譜峰為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物M2。另根據(jù)圖4中色譜p、a和b的質(zhì)譜圖并參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)一步分析鑒定出，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物M1為大豆皂苷Ⅱ糖鏈末端脫去一個(gè)鼠李糖（Rha）生成的大豆皂苷Ⅳ，M2為大豆皂苷Ⅱ脫去整個(gè)糖鏈生成的大豆皂苷元B。大豆皂苷Ⅱ及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物大豆皂苷Ⅳ、大豆皂苷元B的保留時(shí)間（RT）值和質(zhì)譜碎片離子模式數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖3 在PBS系統(tǒng)下人腸道菌群對(duì)大豆皂苷Ⅱ轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LC/MS離子色譜圖Fig.3 Ion chromatograms of soyasaponinⅡ（s，p）and its metabolites（a，b）by human intestinal microflora in the PBS system

圖4 色譜p、a和b中各主要色譜峰（RT=7.41、7.51、9.75 min）對(duì)應(yīng)的ESI+質(zhì)譜圖Fig.4 Positive mode mass spectra of soyasaponin II（p，RT=7.41 min），soyasaponin III（a，RT=7.51 min）and soyasapogenol B（b，RT=9.75 min）

表1 大豆皂苷Ⅱ、Ⅳ和大豆皂苷元B的HPLC和MS數(shù)據(jù)Table 1 HPLC and Mass Spectral Data of SoyasaponinⅡandⅣand Soyasapogenol B

2.3 大豆皂苷Ⅱ在體外PBS模型中代謝動(dòng)力學(xué)模式

人腸道菌群中有許多水解苷鍵的代謝酶，主要有β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、硝基還原酶等[14]，不同的糖苷酶活力造成代謝積累的皂苷代謝產(chǎn)物不同，進(jìn)一步會(huì)表現(xiàn)出不同的代謝動(dòng)力曲線(xiàn)。利用HPLC/MS儀器檢測(cè)不同代謝時(shí)間下的樣品，使用MassLynx 4.1工作站收集和評(píng)估數(shù)據(jù)得出大豆皂苷Ⅱ的代謝動(dòng)力學(xué)機(jī)制，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 大豆皂苷Ⅱ在PBS系統(tǒng)中的體外代謝動(dòng)力學(xué)Fig.5 In vitro dynamic metabolism of soyasaponinⅡin PBS fermentation system

由圖5看出，4 h時(shí)大豆皂苷Ⅱ的含量已明顯降低，8 h后幾乎完全被微生物酶水解；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物大豆皂苷Ⅳ含量在4 h時(shí)是最高的，隨后逐漸降低，24 h后幾乎完全消失；另一種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物大豆皂苷元B含量逐步增加，在48 h時(shí)達(dá)到最大。說(shuō)明大豆皂苷Ⅱ在此體外模型下被腸道微生物酶轉(zhuǎn)化時(shí)，先脫去一個(gè)鼠李糖基生成大豆皂苷Ⅳ，再接著脫去阿拉伯糖與葡萄糖酸組成的雙糖鏈，最終生成大豆皂苷元B。這與大豆皂苷Ⅰ具有類(lèi)似的代謝模式，兩者最終會(huì)被降解為大豆皂苷元B[7]，但A組皂苷中大豆皂苷Ab的降解模式除了產(chǎn)生大豆皂苷元A還會(huì)積累帶有一分子葡萄糖酸糖鏈的大豆皂苷元 A[8]，說(shuō)明A組和B組大豆皂苷在腸道中的代謝模式有所不同。

3 結(jié)語(yǔ)

大豆皂苷Ⅱ在BHI和PBS兩種模擬系統(tǒng)下均會(huì)被人腸道微生物降解，而在PBS中會(huì)12 h后會(huì)完全降解。在0～4 h內(nèi)大豆皂苷Ⅱ在PBS中被腸內(nèi)菌群酶水解為大豆皂苷Ⅳ，48 h后代謝轉(zhuǎn)化為大豆皂苷元B。基于這些發(fā)現(xiàn)，推測(cè)來(lái)自膳食或藥物的大豆皂苷Ⅱ在人體腸道內(nèi)會(huì)被降解以大豆皂苷Ⅳ和大豆皂苷元B的形式吸收，所以在研究大豆皂苷Ⅱ藥理活性的同時(shí)，有必要展開(kāi)對(duì)大豆皂苷Ⅳ和大豆皂苷元B的研究。

[1]Hu J，Lee S O，Hendrich S，et al.Quantification of the group B soyasaponins by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（9）：2587-2594.

[2]Lee S O，Simons A L，Murphy P A，et al.Soyasaponins lowered plasma cholesterol and increased fecal bile acids in female golden Syrian hamsters[J].Experimental Biology and Medicine，2005，230（7）：472-478.

[3]Takahashi S，Hori K，Hokari M，et al.Inhibition of human renin activity by saponins[J].Biomedical Research，2010，31（2）：155-159.

[4]劉宏帥，吳曉俊，胡之璧.大豆皂苷藥理活性及抗癌機(jī)制研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2013，40（1）：79-84.

LIU Hongshuai,WU Xiaojun,HU Zhibi.Pharmacological studies and anti-cancer mechanisms of soyasaponins:research advances [J].Journal of International Pharmaceutical Research，2013，40（1）：79-84.（in Chinese）

[5]Kim D H.Review：herbal medicines are activated by intestinal microflora[J].Natural Product Sciences，2002，8（2）：35-43.

[6]Hu J，Zheng Y L，Hyde W，et al.Human fecal metabolism of soyasaponin I[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（9）：2689-2696.

[7]Chang S Y，Han M J，Han S J，et al.Metabolism of soyasaponin I by human intestinal microflora and its estrogenic and cytotoxic effects[J].Biomolecules&Therapeutics，2009，17（4）：430-437.

[8]Chang S Y，Han M J，Joh E H，et al.Liquid chromatography/mass spectrometry-based structural analysis of soyasaponin Ab metabolites by human fecal microflora[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2010，52（5）：752-756.

[9]Kinjo J，Yokomizo K，Hirakawa T，et al.Anti-herpes virus activity of fabaceous triterpenoidal saponins[J].Biological& Pharmaceutical Bulletin，2000，23（7）：887-889.

[10]Oda K，Matsuda H，Murakami T，et al.Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derived from medicinal and food plants [J].Biological Chemistry，2000，381（1）：67-74.

[11]Zheng Y，Hu J，Murphy P A，et al.Rapid gut transit time and slow fecal isoflavone disappearance phenotype are associated with greater genistein bioavailability in women[J].Journal of Nutrition，2003，133（10）：3110-3116.

[12]Zhang W，Tang F Y，Yeo M C，et al.Fermentation of group B soyasaponins with probiotic Lactobacillus rhamnosus[J].Journal of Food Biochemistry，2012，36（2）：179-188.

[13]肖軍霞，張聲華.大豆皂苷的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜研究[J].中藥材，2006，29（3）：229-232.

XIAO Junxia,ZHANG Shenghua.Study on syasaponins by HPLC-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Journal of Chinese Medicinal Materials，2006，29（3）：229-232.（in Chinese）

[14]夏小燕，居文政，談恒山.腸道菌群對(duì)中藥皂苷類(lèi)成分的代謝研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（2）：96-98.

XIA Xiaoyan,JU Wenzheng,TAN Hengshan.Metabolism of saponins from the TCM by intestinal microflora:research advances [J].Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine，2008，15（2）：96-98.（in Chinese）

In vitro Metabolism of Soyasaponin II by Human Intestinal Microflora

SANG Shangyuan， GUANG Cuie*， JIANG Bo
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To investigate the metabolism of soyasaponin II by human intestinal microorganisms，the in vitro metabolic transformation of soyasaponin II by intestinal flora in the Brain Heart Infusion（BHI）broth and Phosphate Buffered Saline （PBS）systems was studied for 48 hours，and its metabolites were analyzed and identified by HPLC/MS.The results showed that soyasaponin II was firstly metabolized into soyasaponin IV by intestinal flora and was eventually translated into soyasapogenol B at 48 hours.The above results suggested that soyasaponins lost their sugar moieties due to hydrolysis and yielded smaller and more hydrophobic metabolites by human gut microorganisms.

soyasaponin II，soyasapogenol B，intestinal microflora，HPLC，MS

R 285.5

A

1673—1689（2015）05—0470—05

2014-03-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201289）；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主探索課題（SKLF-ZZB-201208）。

*通信作者：光翠娥（1976—），女，湖北仙桃人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與功能因子方面的研究。

E-mail：guang1226@hotmail.com