吳明霞， 趙文凈

（寧德師范學(xué)院 生物系，福建 寧德 352100）

分階段控制溫度提高胞外多糖產(chǎn)量

吳明霞， 趙文凈

（寧德師范學(xué)院 生物系，福建 寧德 352100）

利用冬蟲夏草頭孢菌發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖，研究不同溫度下對菌體生長和胞外多糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：26℃是菌體生長的最適溫度，28℃是產(chǎn)物積累的最適溫度。在此基礎(chǔ)上，提出分階段控制溫度工藝。通過響應(yīng)面法分析，得到優(yōu)化方案為第一階段溫度26℃，變溫時間17 h，第二階段溫度28.5℃，胞外多糖產(chǎn)量10.92 g/L，比28℃恒溫培養(yǎng)提高了25.5%。

分階段控制溫度工藝；胞外多糖；響應(yīng)面法

微生物胞外多糖是微生物在生長過程中產(chǎn)生的、存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性或不溶性多糖，胞外多糖易與菌體分離，可通過深層發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[1]。近年來胞外多糖已發(fā)展成為一類新型的發(fā)酵產(chǎn)品，除藥用外還可作為增稠劑、懸浮劑和穩(wěn)定劑，廣泛用于化工、石油開采、醫(yī)藥加工、食品[2]和化妝品等領(lǐng)域。

溫度對發(fā)酵的影響及其調(diào)節(jié)控制是影響有機(jī)體生長繁殖最重要的因素之一，因為任何生物化學(xué)的酶促反應(yīng)與溫度變化有關(guān)。溫度對發(fā)酵的影響是多方面且錯綜復(fù)雜的，主要表現(xiàn)在對細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成、發(fā)酵液的物理性質(zhì)和生物合成等方面。一般而言，最適發(fā)酵溫度是既適合菌體生長又適合代謝合成的溫度，但最適生長溫度與最適代謝合成的溫度往往是不一致的[3]。目前冬蟲夏草菌絲體[4]發(fā)酵溫度的研究大部分處于恒溫培養(yǎng)階段，對于采用分階段控制溫度工藝，提高胞外多糖產(chǎn)量的方法，國內(nèi)外鮮有報道。作者研究冬蟲夏草菌絲體分階段控制溫度工藝，以期對胞外多糖產(chǎn)量有顯著提高。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種冬蟲夏草頭孢菌。

1.1.2 斜面培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 種子培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖20，蛋白胨5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.13，麥麩50；pH自然。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖100，蔗糖20，K2HPO40.15，MgSO4·7H20 0.12；pH自然[5]。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法將菌種接種于PDA斜面上，于24～25℃下恒溫培養(yǎng)5～6 d，菌絲即可長滿斜面；將頂端菌絲體接種于種子培養(yǎng)基中，于24℃搖床160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，備用[6]。

1.2.2 恒溫培養(yǎng)按8%接種體積分?jǐn)?shù)將種子培養(yǎng)基接入裝有100 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于25、26、27、28、29℃的160 r/min搖床恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，每隔2小時測定菌液的菌體干重及胞外多糖產(chǎn)量。

1.2.3 分階段控制溫度培養(yǎng)按8%接種體積分?jǐn)?shù)將種子培養(yǎng)基接入裝有100 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于搖床160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，每隔2小時測定菌體干重及胞外多糖產(chǎn)量。

1.3 胞外多糖測定方法

采用苯酚-硫酸法[7]。

1.4 菌體干重的測定

取一定量的發(fā)酵液，用已烘干并稱重的濾紙過濾，用水清洗至洗液不再帶有發(fā)酵液顏色為止。在80℃恒溫的烘箱中烘至恒質(zhì)量，在干燥器中冷卻至常溫，稱質(zhì)量。

1.5 響應(yīng)面法設(shè)計

以第一階段溫度、變溫時間、第二階段溫度3個因素對胞外多糖產(chǎn)量的影響并用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，以胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，試驗因素編碼及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.6 數(shù)據(jù)分析

Design Expert8.0.5.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對胞外多糖產(chǎn)量的影響

由圖1a可知，25～29℃菌體生長出現(xiàn)延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。培養(yǎng)溫度25℃時，0～16 h為延遲期，菌體生長緩慢；16 h后菌體出現(xiàn)對數(shù)期，菌體快速生長；培養(yǎng)溫度29℃時，0～12 h為延遲期，12～36 h為對數(shù)期，36 h菌體進(jìn)入穩(wěn)定期。在溫度為29℃時，延遲期縮短了4 h，這可能因為溫度過高使菌體生長過快，使菌體提前進(jìn)入對數(shù)期。由于培養(yǎng)溫度26℃時菌體生長最好，因此分階段控制溫度工藝選取菌體生長的最適溫度26℃作為第一階段溫度。

由圖1b所示，在菌體生長的不同階段均有胞外多糖生成，29℃時由于溫度的升高使胞外多糖大量釋放，這可能由于提前進(jìn)入衰亡期使菌體在穩(wěn)定期胞外多糖產(chǎn)量下降。而28℃時菌體在穩(wěn)定期后期胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高，因此分階段控制溫度工藝選取產(chǎn)胞外多糖的適宜溫度28℃作為第二階段溫度。因為胞外多糖在菌體進(jìn)入對數(shù)期開始大量釋放，因此分階段控制溫度工藝選取16 h作為變溫時間。

圖1 溫度對菌體生長（a）和胞外多糖產(chǎn)量（b）的影響Fig.1 Effect of temperature on the bacteria growth and the yield of expolysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化方案

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果試驗因素水平及設(shè)計方案見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素水平及設(shè)計方案和結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗利用Design-Expert 8.0.5.0軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式逐步回歸擬合[8]，得到的數(shù)學(xué)模型：

由表3可知，模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察。當(dāng)≥F值小于0.05時，即表示該指標(biāo)顯著；當(dāng)P≥F值小于0.001時，即表示該指標(biāo)極顯著。結(jié)果表明：一次項A、B顯著，C極顯著；二次項A2、B2和C2同樣極顯著；交互項AB顯著，AC和BC不顯著，且失擬性p=0.062 7≥0.05，對模型是有利的，無失擬因素存在，因此可用該回歸方程代替實驗真實值進(jìn)行分析。

表3 回歸統(tǒng)計分析結(jié)果Table 3 Regression analysis

通過比較回歸方程中的一次項系數(shù)絕對值的大小，可判斷因素影響的大小關(guān)系[9]，因此3個因素對胞外多糖產(chǎn)量影響的大小分別為：第二階段溫度≥變溫時間≥第一階段溫度，由以上分析可知，各因素對胞外多糖產(chǎn)量的影響復(fù)雜，并非簡單的線性關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析和優(yōu)化通過模型方程所作的響應(yīng)曲面圖，可直觀地描述各因素對響應(yīng)值的影響和各個因素間的交互作用。由圖2—4可知，曲面均是開口向下的凸面，其中心位于所考察區(qū)域內(nèi)，說明在考察的區(qū)域內(nèi)存在響應(yīng)值的極大值，同時響應(yīng)面為高度卷曲的曲面。圖2—4等高線可直觀反映了兩種因素交互作用對相應(yīng)值的影響。比較圖形可知，第二階段溫度是影響胞外多糖產(chǎn)量的最顯著因素，表面等高線陡峭；變溫時間次之，第一階段溫度影響最小，表現(xiàn)為等高線平滑，且隨數(shù)值的增加而減少，響應(yīng)值變化較小。

圖2 第一階段溫度和第二階段溫度交互作用對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of interaction of the first stage temperature and the second stage temperature on the yield of expolysaccharide

圖3 變溫時間和第二階段溫度交互作用對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of interaction of the second stage temperature and time of variable temperature on the yield of expolysaccharide

圖4 第一階段溫度和變溫時間交互作用對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of interaction of the first stage temperature and time of variable temperature on the yield of expolysaccharide

通過軟件分析，分階段控制溫度的最佳工藝為：第一階段溫度26.05℃，變溫時間16.84 h，第二階段溫度28.54℃，得到胞外多糖產(chǎn)量11.15 g/L。

為檢驗RSM法的可靠性，采用上述最佳方案提高胞外多糖產(chǎn)量的試驗，同時考慮實際操作的情況，將優(yōu)化方案修正為第一階段溫度26℃，變溫時間 17 h，第二階段溫度 28.5℃時胞外多糖產(chǎn)量10.92 g/L，與實際值基本吻合，比28℃恒溫培養(yǎng)提高了25.5%。

3 結(jié)語

1）菌體生長和產(chǎn)物積累的最適溫度分別為26、28℃。

2）通過響應(yīng)面法分析，分階段控制溫度的最佳工藝為：第一階段溫度26℃，變溫時間17 h，第二階段溫度28.5℃，胞外多糖產(chǎn)量10.92 g/L，比28℃恒溫培養(yǎng)提高了25.5%。

通過試驗探討響應(yīng)面法提高胞外多糖產(chǎn)量優(yōu)化的可行性，結(jié)果表明，通過該法優(yōu)化得到的工藝 基本準(zhǔn)確可靠，具有一定的實用價值。

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Two-Stage Temperature Controlling Strategy For Improving the Yield of Expolysaccharide

WU Mingxia， ZHAO Wenjing
（Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde 352100，China）

The fermentation production of expolysaccharide from Cordyceps militaris was studied at different temperature.The results showed that the optimal growth temperature was at 26℃and the highest yield of expolysaccharide accumlation temperature was at 28℃.Thus，the two-stage temperature control strategy was developed based on RSM.When pre-fermentation temperature was kept at 26℃for 17 hours and changed to 28.5℃，the yield increased to 10.92 g/L which was 25.5% higher than that of fermentation at single temperature at 28℃.

two-stage temperature control strategy，expolysaccharide，RSM

TQ 920.1

A

1673—1689（2015）05—0542—05

2014-02-08

福建省教育廳A類項目（JA12341）。

吳明霞（1979—），女，吉林白城人，工學(xué)碩士，講師，主要從事微生物代謝調(diào)控方面的研究。E-mail：wuming0224@163.com