王麗萍， 邵侃凱， 高曉冬， 中西秀樹

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

基于酵母產(chǎn)孢的syntaxin家族蛋白SNARE區(qū)域功能分析

王麗萍， 邵侃凱， 高曉冬， 中西秀樹*

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

真核細(xì)胞中大部分膜融合過程由SNARE蛋白介導(dǎo)，但其功能和調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全清楚。酵母孢子形成是研究囊泡融合機(jī)制包括SNARE蛋白的理想模型系統(tǒng)。在該過程中涉及t-SNARE蛋白Sso1，它是突觸囊泡融合所需蛋白syntaxin 1A的同源物，兩者SNARE區(qū)域有51%的同源性。盡管如此，將SSO1的SNARE區(qū)域完全替換成syntaxin 1A，而構(gòu)建的嵌合體卻無法回補(bǔ)sso1△突變的產(chǎn)孢缺陷。為了確定哪些殘基為Sso1功能所必須，作者進(jìn)行了嵌合體和突變分析，發(fā)現(xiàn)Sso1/syntaxin 1A嵌合體中syntaxin 1A的SNARE區(qū)域的220位丙氨酸換成谷氨酸后獲得產(chǎn)孢功能。另外，Sso1發(fā)生相應(yīng)的突變-218位谷氨酸突變成丙氨酸后失去其功能。因此，218位谷氨酸殘基為Sso1產(chǎn)孢功能所必須。

SNARE；人源化；釀酒酵母；Sso1p；syntaxin1A

在真核生物中，囊泡融合機(jī)制是高度保守的，SNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors；可溶性NSF附著蛋白受體）蛋白是融合蛋白中的重要成員[1-2]。SNARE蛋白是保守性很強(qiáng)的蛋白家族，經(jīng)常被分為兩組：QSNARE蛋白和R-SNARE蛋白[3]。SNARE蛋白位于特定的膜上，只有當(dāng)同源的Q-SNARE蛋白和RSNARE蛋白結(jié)合時(shí)，泡膜才能融合。

在神經(jīng)元的突觸囊泡融合過程中，syntaxin-1[4]和SNAP-25扮演Q-SNARE角色，synaptobrevin則扮演著R-SNARE角色。當(dāng)囊泡膜上的synaptobrevin與syntaxin-1和 SNAP-25結(jié)合在一起時(shí)，突觸囊泡中的神經(jīng)遞質(zhì)就會(huì)釋放出來，傳遞給突觸后膜[1，3，5-7]。SNARE蛋白不僅和神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)，也和粘蛋白及血小板升高引起的人類疾病有關(guān)。研究表明，抑制SNARE蛋白功能可導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病[8-9]。SNARE融合過程受到complexin[10]、Tomosyn[11-12]、Munc18/nSec-1[13]等多種蛋白質(zhì)的調(diào)控，但調(diào)控機(jī)制尚不明確。

酵母細(xì)胞中同樣存在 SNARE融合系統(tǒng)，syntaxin-1在突觸囊泡融合過程中的作用機(jī)制可利用酵母的SNARE融合系統(tǒng)來研究。

酵母中有兩個(gè) syntaxin蛋白——Sso1p和Sso2p，他們是哺乳動(dòng)物syntaxin1的同源物且彼此高度相似。Sso1p和Sso2p在酵母營養(yǎng)細(xì)胞中共同執(zhí)行基本功能——與SNARE蛋白Sec9p，Snc1p和Snc2p形成質(zhì)膜復(fù)合體[14]。在孢子形成過程中則特異性地要求Sso1p存在[15-16]。在該過程中Spo20p代替Sec9p，與Sso1p、Snc1p和Snc2p形成復(fù)合體，促使紡錘體極點(diǎn)上prospore membrane（PrM）的擴(kuò)展。Sso1p缺失的酵母因PrM無法擴(kuò)展而不能形成孢子。

在SNAREs參與的孢子形成過程中，SSO1和SPO20是PrM形成所必需的基因[16]。Hideki Nakanishi等人已研發(fā)出監(jiān)測(cè)PrM形成過程中囊泡融合的技術(shù)。這類現(xiàn)象也可通過熒光顯微鏡觀察到，并且在活細(xì)胞中可看到PrM的延伸[17-18]。因此，PrM的形成過程是研究囊泡融合機(jī)理的一個(gè)理想操作模型系統(tǒng)。SNARE蛋白基因在進(jìn)化過程中比較保守，可以將 Sso1p的 SNARE區(qū)域替換成 syntaxin1的SNARE區(qū)域從而構(gòu)建人源化的膜融合體系。根據(jù)改造得到的菌株不僅可用于在酵母細(xì)胞中研究人類突觸囊泡融合機(jī)理，還可用于醫(yī)療和工業(yè)用途，其中包括建立神經(jīng)肉毒素的檢測(cè)系統(tǒng)。而且，它們也是篩選參與突觸囊泡融合新基因的非常有用的工具。

作者通過嵌合體的構(gòu)建對(duì)Sso1p的SNARE區(qū)域的產(chǎn)孢功能區(qū)進(jìn)行了定位，并成功構(gòu)建了sso1△sso2△突變株，為篩選與syntaxin1A作用的蛋白或藥物提供了更為簡(jiǎn)便的方法。也為后續(xù)人源化SNARE膜融合系統(tǒng)的構(gòu)建及相關(guān)理論研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒釀酒酵母出發(fā)菌株 AN120、HJ3（sso1△spo20△）、質(zhì)粒pFA6a-kanMX6、質(zhì)粒pFA6a-his3MX6、質(zhì)粒pRS314、質(zhì)粒pRS304、質(zhì)粒pRS316、質(zhì)粒pRS426：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶：東洋紡公司；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶及T4-DNA Ligase：TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒：上海生工生物公司；其他試劑：均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）YPAD培養(yǎng)基：每升含酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，腺嘌呤30 mg；

2）YNB選擇培養(yǎng)基：每升含酵母基礎(chǔ)氮源6.7 g，葡萄糖20 g，補(bǔ)加適量必須元素；

3）YPAce培養(yǎng)基：每升含酵母膏10 g，蛋白胨20 g，乙酸鉀20 g，腺嘌呤30 mg；

4）產(chǎn)孢培養(yǎng)基：每升含乙酸鉀20 g；

5）5-FOA（5-Fluoroorotic Acid）[19]培養(yǎng)基：每升含酵母基礎(chǔ)氮源6.7 g，5-氟乳清酸1 g，葡萄糖20 g，補(bǔ)加適量必須元素；

6）LB-氨芐培養(yǎng)基：每升含酵母膏5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，氨芐100 mg；

7）G418培養(yǎng)基：每升含酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，腺嘌呤30 mg，G418 500 mg。固體培養(yǎng)基添加2 g/dL的瓊脂粉。

1.2 基因敲除

基因敲除方法見文獻(xiàn) [20]。其中質(zhì)粒pFA6akanMX6為敲除SSO1的模板，質(zhì)粒pFA6a-his3MX為敲除SSO2的模板，PCR引物見表1。

表1PCR引物

Table 1 Primers

?

1.3 產(chǎn)孢分析

將含質(zhì)粒的釀酒酵母在YNB選擇培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)過夜，取500 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至4.5 mL YPAce培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～24 h，收集細(xì)胞，無菌水洗后重懸于3 mL產(chǎn)孢培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 h，觀察記產(chǎn)孢率。每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化兩次，每次選3個(gè)單菌落計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)不少于500。

1.4 PrM的觀察

將以pRS304為載體構(gòu)建的質(zhì)粒單酶切，回收所得線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化sso1△缺陷株，色氨酸缺陷平板篩選陽性克隆。用pRS426-G20轉(zhuǎn)化所得菌株，色氨酸、尿嘧啶缺陷平板篩選陽性克隆，按產(chǎn)孢分析方法培養(yǎng)，產(chǎn)孢培養(yǎng)基中培養(yǎng)6、7、8 h時(shí)各取500 μL培養(yǎng)液收集細(xì)胞，水洗后重懸于50 μL無菌水，加450 μL甲醛，30℃搖床處理30 min。收集細(xì)胞，無菌水洗兩次后重懸于100 μL無菌水，取5 μL細(xì)胞懸液與5 μL DAPI溶液混合，制片觀察PrM。

1.5 營養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)分析

以pRS316SSO1pr-SSO1轉(zhuǎn)化sso1△單倍體缺陷株，以篩選所得陽性克隆為出發(fā)菌株敲除SSO2，得sso1△sso2△雙缺陷型菌株。將待驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)入sso1△sso2△，在YNB選擇性平板上篩選出陽性克隆，隨后劃線到5-FOA平板上觀察生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與討論

2.1 Sso1p與syntaxin1A的嵌合體不能使酵母產(chǎn)孢

Syntaxin含有具三個(gè)短螺旋的 N端結(jié)構(gòu)域、SNARE區(qū)域及帶有極短親水尾的C端跨膜結(jié)構(gòu)域[3]。膜融合過程中，syntaxin的 SNARE區(qū)域與其他SNARE蛋白結(jié)合形成四螺旋束結(jié)構(gòu)，將兩側(cè)膜拉近從而進(jìn)行隨后的融合。Syntaxin的SNARE區(qū)域?yàn)樽陨鞱端結(jié)構(gòu)及多種其他調(diào)控蛋白的作用部位，故在本研究中考慮將 Sso1p的 SNARE區(qū)域替換成syntaxin1A的SNARE區(qū)域。

以 pRS314為載體構(gòu)建含syntaxin1A（sytx1A）與Sso1p的嵌合體Sso1p/sytx1A（SNARE區(qū)域）的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化sso1△后觀察其能否產(chǎn)孢。在減數(shù)分裂Ⅱ期，含不同質(zhì)粒的酵母細(xì)胞均能形成四個(gè)新的細(xì)胞核；含Sso1p的釀酒酵母可形成PrM，進(jìn)而形成孢子，嵌合體則只在紡錘體處形成點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)而無法擴(kuò)張，說明其缺乏Sso1p在孢子形成過程中的功能，意味著不能將 Sso1p的 SNARE區(qū)域全部替換成sytx1A的SNARE區(qū)域，見圖1。

圖1 含重組質(zhì)粒的sso1△在產(chǎn)孢培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 h后PrM形態(tài)Fig.1 Shape of PrM of sso1△containing recombinant plasmid which cultured for 7 h in spore medium

2.2 A220為嵌合體無產(chǎn)孢功能的原因

Syntaxin1A與sso1p的SNARE區(qū)域有51%的同源性，將其替換sso1p的SNARE區(qū)域后卻使其失去產(chǎn)孢功能 （本研究中氨基酸編號(hào)為其原本在Sso1p與syntaxin1A中的編號(hào)），為何如此高的同源性功能卻有如此大的差異？故設(shè)計(jì)了一系列嵌合體對(duì)Sso1p產(chǎn)孢功能區(qū)進(jìn)行定位，見圖2。產(chǎn)孢分析結(jié)果表明：保留Sso1p第214～221位氨基酸，其余SNARE區(qū)域全部替換成sytx1A，嵌合體仍能產(chǎn)孢，意味著 Sso1p的 214～221位氨基酸為其形成SNARE復(fù)合體所必須。

根據(jù)該結(jié)果，我們大膽假設(shè)當(dāng)位于sytx1A與其他SNARE蛋白α螺旋的接觸表面上的與Sso1p有顯著性質(zhì)差異的氨基酸發(fā)生突變后，可能使嵌合體具產(chǎn)孢功能。隨后在Sso1p/sytx1A（SNARE）基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了三個(gè)定點(diǎn)突變：I（209）M，HDM （213-215）TQL，AM（220，221）EE；結(jié)果sytx1A的SNARE區(qū)域發(fā)生AM（220，221）EE突變后能使sso1△產(chǎn)孢。進(jìn)一步定點(diǎn)突變A（220）E、M（221）E，最終發(fā)現(xiàn)sytx1A發(fā)生A（220）E突變后具產(chǎn)孢功能，說明A220是Sso1p/sytx1A（SNARE）無產(chǎn)孢功能的原因。Sso1p/ sytx1A嵌合體僅將A220這一個(gè)氨基酸突變成E后便具有產(chǎn)孢活性，該嵌合體可用于與sytx1A相作用的蛋白質(zhì)或藥物的篩選。

圖2 利用Sso1p與sytx1A的嵌合體定位Sso1p產(chǎn)孢功能區(qū)Fig.2 Mapping of the sporulation-specific functions in Sso1p using fusions with sytx1A

2.3 Sso1p功能的實(shí)現(xiàn)需要E218

由于Sso1p/sytx1A發(fā)生點(diǎn)突變A（220）E后具產(chǎn)孢功能，A220為Sso1p/sytx1A不能產(chǎn)孢的原因，在Sso1p中進(jìn)行相應(yīng)的突變E（218）A后則可以驗(yàn)證Sso1p的產(chǎn)孢功能是否特異性需要E的存在。

將Sso1p的E218突變成A后觀察PrM狀態(tài)并進(jìn)行產(chǎn)孢分析。結(jié)果含野生型Sso1p的菌株能形成4個(gè)PrM，突變體則只能形成點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，野生型的Sso1p發(fā)生該突變后無法形成PrM，見圖3。失去產(chǎn)孢功能，進(jìn)一步證實(shí)該位點(diǎn)氨基酸E對(duì)產(chǎn)孢功能的重要性。

釀酒酵母中Sso1p為產(chǎn)孢所必須，其在營養(yǎng)細(xì)胞中功能與Sso2p相同[21]。在單倍體酵母中敲除SSO1和SSO2后，細(xì)胞將無法存活。于是構(gòu)建了sso1△sso2△雙缺陷型單倍體菌株，可利用營養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證嵌合體的功能。

圖3 含重組質(zhì)粒的sso1△在產(chǎn)孢培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 h后PrM形態(tài)Fig.3 Shape of PrM of sso1△containing recombinant plasmid which cultured for 7 h in spore medium

將上述嵌合體轉(zhuǎn)入sso1△sso2△突變株，所得轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)移至含5-FOA的平板上使其丟失含野生型SSO1的質(zhì)粒，嵌合體將成為細(xì)胞中惟一的Sso蛋白[19]；觀察轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)狀況。在不含5-FOA的YNB選擇性（缺乏色氨酸、尿嘧啶）平板上，各轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)狀況無明顯差別；轉(zhuǎn)接到含5-FOA的YNB選擇性（缺乏色氨酸）平板上后Sso1p/sytx1A（SNARE）-A（220）E能在 5-FOA平板上生長(zhǎng)，Sso1p/sytx1A（SNARE）、Sso1p E（218）A則不能生長(zhǎng)，見圖4。當(dāng)Sso1p的E218突變成非極性氨基酸A后無法進(jìn)行膜融合，因而不能存活。與上述結(jié)果一致，Sso1p的E218為其形成SNARE復(fù)合體所必須。利用生長(zhǎng)分析所得結(jié)果和產(chǎn)孢分析一致，該系統(tǒng)可用于隨后的高通量篩選與sytx1A作用的基因或藥物，大大簡(jiǎn)化篩選工作。

圖4 營養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)Fig.4 Vegetative cell experiments

3 結(jié)語

作者發(fā)現(xiàn)將酵母中Sso1p的SNARE區(qū)域替換成Sytx1A的SNARE區(qū)域而構(gòu)建的嵌合體Sso1p/ sytx1A無法使釀酒酵母產(chǎn)生孢子，將嵌合體的A220突變成E后則具有產(chǎn)孢活性；而將Sso1p的E218突變成A后則失去了產(chǎn)孢活性，因此E218為Sso1p功能所必須。真核細(xì)胞中存在多種與syntaxin家族蛋白作用的蛋白質(zhì)。Complexin與Tomosyn只存在于哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中，通過與syntaxin1A的SNARE區(qū)域結(jié)合調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的嵌合體Sso1p/sytx1A-A（220）E為利用酵母細(xì)胞研究這些蛋白質(zhì)與sytx1A的作用機(jī)制提供了新的思路。Munc18/Sec-1也存在于釀酒酵母細(xì)胞中，與SNARE復(fù)合體結(jié)合從而調(diào)節(jié)膜融合過程。由于Munc18/Sec-1與SNARE復(fù)合體結(jié)合時(shí)，E218處于結(jié)合位點(diǎn)上，因此該氨基酸發(fā)生突變后可能影響這兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合。此外，形成SNARE核心復(fù)合體時(shí)，來自于4個(gè)螺旋的側(cè)鏈相接觸形成16個(gè)片層，位于片層上的氨基酸直接控制SNARE復(fù)合物的形成。而E218位于片層之外，發(fā)生點(diǎn)突變后使Sso1p失去活性，因此E218有可能調(diào)控SNARE復(fù)合體的形成，為釀酒酵母中膜融合機(jī)制的研究提供了參考。

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Functional Analysis of the SNARE Domain of Syntaxin Family Proteins Using Yeast Sporulation

WANG Liping， SHAO Kankai， GAO Xiaodong， NAKANISHI Hideki*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In eukaryotic cells，most of membrane fusion processes are mediated by SNARE proteins. However，its functional and regulatory mechanisms have not been fully understood.Previous study have shown that yeast sporulation was an ideal model system to manipulate and investigate vesicle fusion machinery including SNARE proteins.The t-SNARE protein Sso1 involved in this process is an orthologue of syntaxin 1A which is required for the synaptic vesicle fusion，both share 51% homology at the SNRE domains.However，although their functional and amino acid sequence are similar，Sso1/syntaxin 1A chimera cannot complement the sporulation deficiency of sso1△mutant when SNARE domain of Sso1 is replaced completely by syntaxin 1A.To determine which residues are critical for Sso1 function，chimera and mutational analyses are further conducted.The resultsshowed that the SSO1/syntaxin 1A chimera gain the functionality by replacing Ala220 residue to Glu in the syntaxin 1A SNARE domain.By contrast，Sso1 lose its function by mutating the corresponding amino acid residue，Glu218 into Ala.Thus，Glu218 residue is specifically required for Sso1 function.

SNARE，humanization，Saccharomyces cerevisiae，Sso1p，syntaxin1A

Q 784

A

1673—1689（2015）05—0530—06

2014-00-00

國家 “111計(jì)劃”項(xiàng)目 （111-2-06）；教育部科學(xué)研究項(xiàng)目 （313027）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20120093110001）；江南大學(xué)自主科研項(xiàng)目（JUSRP311A02）。

*通信作者：中西秀樹（1973—），男，日本人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事分子生物學(xué)、酵母遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和糖生物學(xué)方面的研究。E-mail：hideki@jiangnan.edu.cn