韋素真， 張 會， 姚 楊，岳苗苗，李 杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

天門冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表達(dá)

韋素真， 張 會， 姚 楊，岳苗苗，李 杰*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

根據(jù)NCBI中的黑曲霉天門冬酰胺酶基因asp序列（GI：145231287）設(shè)計特異性引物，從黑曲霉CICC2462基因組中擴增asp基因編碼區(qū)，構(gòu)建其黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-Asp。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉，篩選以asp基因置換糖化酶基因glaA的同源重組轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析和酶活檢測。獲得8株在glaA位點發(fā)生基因置換的同源重組轉(zhuǎn)化子，并對其中4株的上清液進(jìn)行檢測。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在42 000處有目的蛋白質(zhì)條帶，重組菌株的目的蛋白質(zhì)表達(dá)量為185～417 μg/mL，發(fā)酵液最高酶活為21 111 U/mL。

天門冬酰胺酶；黑曲霉；基因置換；Berthelot顯色反應(yīng)

天門冬酰胺酶（Asparaginase）又叫天冬酰胺酶、 L-天門冬酰胺酶、門冬酰胺酶等，它是一種催化天門冬酰胺水解生成天門冬氨酸和氨的酶，廣泛存在于植物、動物組織及微生物中[1]。來自于黑曲霉的天門冬酰胺酶是一種食品添加劑，其功能是降低油炸或膨化食品中的丙烯酰胺含量。2002年4月，瑞典國家食品管理局和斯德哥爾摩大學(xué)研究人員率先報道，在一些燒烤和油炸的淀粉類食品中，例如油炸土豆片、薯條等中檢出丙烯酰胺，而且含量超過飲水中允許最大限量的500多倍[2]。之后英國、瑞士、挪威和美國等國家也相繼報道了類似結(jié)果[3]。丙烯酰胺具有遺傳毒性、神經(jīng)毒性和潛在致癌性，因此控制食品中丙烯酰胺含量尤其重要[4]。丙烯酰胺主要是通過美拉德反應(yīng)，由食品原料中的天冬酰胺和還原糖在高溫加熱過程中形成的[5]，天門冬酰胺酶可以將丙烯酰胺的前體物——天冬酰胺轉(zhuǎn)化成天冬氨酸，從而減少丙烯酰胺的含量[6]，可以從源頭上控制丙烯酰胺的生成[7]。荷蘭的帝斯曼公司成功地研發(fā)了一種酶制劑——PreventASeTM，經(jīng)過天冬酰胺酶反應(yīng)過程，可有效消除90%以上的丙烯酰胺成分，并申報了專利[8]。2005年我國衛(wèi)生部發(fā)布公告，要求人們注意食品中的丙烯酰胺的含量，呼吁采取積極的措施減少其含量[9]，并在2009年把天門冬酰胺酶列為食品添加劑[10]，但是國內(nèi)關(guān)于天門冬酰胺酶作為食品添加劑的研究和應(yīng)用報道很少。作者擬構(gòu)建食品級天門冬酰胺酶工程菌，為天門冬酰胺酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體黑曲霉CICC2462：由肇東市日成酶制劑有限公司提供；農(nóng)桿菌AGL1：由作者所在實驗室保存；大腸桿菌菌株E.coli DH5α：購自北京全式金生物技術(shù)公司。載體pSZHG：由作者所在實驗室保存；載體pSZHG-Asp：由作者所在實驗室構(gòu)建；PMD18-T vector：購自大連寶（TaKaRa）生物工程公司。

1.1.2 試劑各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq酶、核酸相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒等：購自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、瓊脂糖等：購自BBI公司；氨芐青霉素、卡納抗生素、潮霉素B、蛋白胨、氯化鈣、氯化鈉、檸檬酸鈉、水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉、天門冬酰胺等：均為國產(chǎn)試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基、YEB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基：均按照常規(guī)實驗室標(biāo)準(zhǔn)配置[11]。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉基因組DNA提取黑曲霉基因組的提取方法采用CTAB方法[12]。

1.2.2 引物設(shè)計根據(jù)Genebank中公布的黑曲霉天門冬酰胺酶基因Asp序列 （序列號GI：145231287）以及黑曲霉表達(dá)載體pSZHG多克隆位點的特征，用Primer5.0軟件分別設(shè)計Asp基因特異引物。根據(jù)黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-Asp的序列以及黑曲霉糖化酶基因位點的序列，設(shè)計轉(zhuǎn)化子、PCR檢測引物及同源重組轉(zhuǎn)化子PCR檢測引物。引物序列見表1。

1.2.3 PCR反應(yīng)PCR基本的反應(yīng)體系如下（25 μL）：5×Buffer 5 μL，Mg2+（25 mmol/L）2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，模板 1 μL，Prime Star Taq酶 0.2 μL，加ddH2O至25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)，72℃終延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。

1.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建將pSZHG、pMD-Asp載體分別用NheⅠ、HindIII限制性內(nèi)切酶酶切，分別回收15 000 bp的載體條帶和1 254 bp的目的基因條帶，連接并構(gòu)建表達(dá)載體pSZHG-Asp。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this research

1.2.5 黑曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化見文獻(xiàn)[12]。

1.2.6 采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法見文獻(xiàn)[13]。

1.2.7 天門冬酰胺酶酶活測定活性測定以及相關(guān)試劑的配置參照文獻(xiàn)[14-15]。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取（NH4）2SO4溶于超純水，配置質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、70、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按表2進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以及天門冬酰胺酶活性的測定[16]。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Table 2 Standard curve

在各管中加入1.2 mL水楊酸溶液，再加入0.10 mL亞硝基鐵氰化鈉溶液和0.10 mL次氯酸鈉溶液，混勻，37℃水浴30 min。用1 cm比色皿，按照表3標(biāo)準(zhǔn)管列分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，反應(yīng)后測定650 nm波長的吸光度，以水作參比，測定各管溶液的吸光度。

表3 天門冬酰胺酶酶活的測定步驟Table 3 Procedure for asparaginase determination

混勻后置37℃水浴30 min，于650 nm處用無氨水調(diào)零，測定各管吸光度。測定管吸光度減去對照管吸光度所得的吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到脫氨反應(yīng)產(chǎn)生的氨質(zhì)量濃度X（μg/mL）計算酶活[17]：

酶活 （μg/（min·mL））=（X μg/30 min）×（1/0.03 mL）=10X/9

酶活性單位定義（U）：在標(biāo)準(zhǔn)條件下，1 mL酶液在37℃與底物作用1 min產(chǎn)生1 μg氨為1個酶活性單位（pH 5.0，37℃）。

2 結(jié)果與討論

2.1 asp基因的擴增

以黑曲霉CICC2462基因組為模板，用asp基因特異性引物進(jìn)行PCR擴增，獲得約1 254 bp的目的片段，見圖1。將該片段克隆至pMD18-T，送交測序。將測序結(jié)果進(jìn)行blast比對分析發(fā)現(xiàn)，該序列與登錄號 GI：145231287的基因序列相似性為100%。

圖1 asp基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification asp

2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

表達(dá)載體pSZHG-asp構(gòu)建見圖2。該載體用XbaI、HindIII雙酶切鑒定，得到大約14 000 bp和2 300 bp的兩條帶，見圖3，證明構(gòu)建正確。

圖2 pSZHG-asp表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of expression vector pSZHG-asp

圖3 pSZHG-asp雙酶切結(jié)果Fig.3 Enzymes digestion of vector pSZHG-asp

2.3 同源重組轉(zhuǎn)化子的篩選

農(nóng)桿菌與黑曲霉共培養(yǎng)之后，挑取篩選平板長出的黑曲霉菌落，搖菌，提取基因組。利用P3、P4引物進(jìn)行PCR檢測，共對19個菌株進(jìn)行檢測，有4株擴增出3 500 bp左右的目的條帶和4 700 bp的glaA基因條帶，為陽性轉(zhuǎn)化子，見圖4。利用P5、P6引物對4株陽性轉(zhuǎn)化子做PCR檢測，結(jié)果均能擴增出1 700 bp左右的目的條帶，因此這4株都是同源重組轉(zhuǎn)化子，見圖5。

圖4 黑曲霉轉(zhuǎn)化子PCR驗證結(jié)果Fig.4 Results of PCR of Aspergillus niger transformants

圖5 黑曲霉轉(zhuǎn)化子同源重組PCR驗證結(jié)果Fig.5 Results of PCR of homologous recombination Aspergillus niger transformants

2.4 天門冬酰胺酶酶活測定

2.4.1 氨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按表1標(biāo)準(zhǔn)管系列分別加入不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，反應(yīng)后在650 nm處測定吸光度，以氨質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6。R2= 0.999 7，表明其線性相關(guān)性較好。

圖6 氨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of ammonium nitrogen assay

2.4.2 酶活測定取出發(fā)菌株和3個同源重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，不同發(fā)酵時間的酶活見表4。最高酶活可達(dá)21 111 U/mL。

2.5 天門冬酰胺酶在重組菌株中的分泌表達(dá)

對培養(yǎng)發(fā)酵10、11 d的菌液，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖7。與出發(fā)菌株相比，3株重組菌株都在約42 000的位置出現(xiàn)了目的蛋白質(zhì)條帶。經(jīng)ALPHAIMAGER SYSTEMS軟件分析，3株重組菌株的目的蛋白質(zhì)表達(dá)量為 185～417 μg/mL，而出發(fā)菌株僅為12 μg/mL。

表4 天門冬酰胺酶在不同發(fā)酵時間的酶活Table 4 Enzyme activity detection at different fermentation time of asparaginase

圖7 表達(dá)蛋白SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE of expressed protein

3 結(jié)語

隨著生活質(zhì)量的提高，食品安全問題越來越引起人們的關(guān)注。丙烯酰胺具有遺傳毒性、神經(jīng)毒性和潛在致癌性。我國已將食品中丙烯酰胺的檢驗列為“十五”國家重大科技專項“食品安全關(guān)鍵技術(shù)”課題。降低食品中丙烯酰胺的方法有很多，但是使用天門冬酰胺酶降解原料中的天門冬酰胺是最為簡便有效的方法。因此，天門冬酰胺酶已在2009年被國家衛(wèi)生部確定為一種食品添加劑。但是我國目前還沒有制定各種食品中丙烯酰胺的限量標(biāo)準(zhǔn)，天門冬酰胺酶的研究和應(yīng)用還沒有得到足夠的重視。

作者以糖化酶生產(chǎn)菌株CICC2462同時作為基因供體和轉(zhuǎn)化受體，以糖化酶基因位點為基因整合的靶位點，構(gòu)建了天門冬酰胺酶工程菌，且在篩選標(biāo)記潮霉素基因表達(dá)框兩側(cè)設(shè)計了順向重復(fù)序列，可在后續(xù)實驗中刪除篩選標(biāo)記基因，達(dá)到食品級表達(dá)系統(tǒng)要求。本研究獲得的工程菌搖瓶發(fā)酵酶活最高已達(dá)到20 000 U/mL以上，具有明確的產(chǎn)業(yè)化的前景。但是目的蛋白質(zhì)產(chǎn)量只有417 μg/mL，這說明表達(dá)的天門冬酰胺酶具有較高的比活，同時也有巨大的提升表達(dá)量的潛力。

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Homologous Expression of Asparaginase Gene in Aspergillus niger

WEI Suzhen， ZHANG Hui， YAO Yang， YUE Miaomiao， LI Jie*
（College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In order to achieve the homologous expression of asparaginase gene asp in Aspergillus niger CICC2462，the asparaginase engineering strains were construced.The specific primers were designed according to asparaginase gene asp sequence in the NCBI（GI：145231287）to amplify the coding region of asp and pSZHG-asp expression vector was constructed.Then agrobacterium mediated method was utilized to transform Aspergillus niger，and homologous recombinations which glucoamylase gene（glaA）was replaced by Asp were screened.The expression products of the transformant were analyzed using SDS-PAGE and enzyme activity detection.Eight homologous recombination strains，where glaA locus was replaced，were obtained，and the supernatant in 4 of them were measured.The result of SDS-PAGE showed protein bands at 42 000，the amount of the recombinated protein was 185～417 μg/mL，and the highest enzyme activity of fermentation broth was up to 21 111 U/mL.

asparaginase，Aspergillus niger，gene replacement，berthelot colour reaction

Q 786

A

1673—1689（2015）05—0554—06

2014-02-19

農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室開放課題資助項目。

*通信作者：李 杰（1972—），男，黑龍江拜泉人，農(nóng)學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事分子遺傳學(xué)與基因工程方面的研究。

E-mail：lijie_neau@126.com