趙孟良，孫雪梅，王麗慧，李 莉

(青海省農(nóng)林科學院菊芋研發(fā)中心 青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016)

43份菊芋種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析

趙孟良，孫雪梅，王麗慧，李 莉

(青海省農(nóng)林科學院菊芋研發(fā)中心 青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016)

【目的】 探明國內(nèi)外菊芋(HelianthustuberosusL.)資源間的親緣關(guān)系遠近及遺傳多樣性?！痉椒ā?以40份國外菊芋資源與3個國內(nèi)栽培品種為材料，選用14條引物進行ISSR分子標記分析，分析他們的遺傳多樣性，利用POPGENE32軟件計算多態(tài)位點比率(PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)。采用NTSYS 2.10軟件計算品種間的相似系數(shù)，進行聚類分析，并對不同類群的形態(tài)學主要特點進行分析?！窘Y(jié)果】 采用14條引物對43份菊芋資源進行PCR擴增，共獲得203個標記，其中多態(tài)性標記199個，多態(tài)性比率為98.0%。采用POPGENE32軟件分析，供試的43份菊芋資源平均有效等位基因數(shù)為1.894 8，平均 Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.467 7，平均 Shannon’s 信息指數(shù)為0.659 0。43份菊芋資源間的相似系數(shù)為0.443～0.955。聚類結(jié)果顯示，供試的43個菊芋資源可聚為2個類群，能很好地將國外菊芋資源與國內(nèi)品種區(qū)分開來。不同類群菊芋的塊莖形態(tài)及顏色有明顯差異?！窘Y(jié)論】 國內(nèi)外菊芋資源間遺傳關(guān)系較遠，且國外資源間存在豐富的遺傳多樣性。

菊芋；種質(zhì)資源；ISSR；遺傳多樣性

菊芋(HelianthustuberosusL.)又名洋姜、鬼子姜，為菊科(Compositae)向日葵屬(Helianthus)多年生草本植物，18世紀末從歐洲傳入中國，之后被人們當作蔬菜栽培食用。菊芋具有極強的抗旱、抗寒、耐鹽堿能力，能夠適應(yīng)惡劣的生長環(huán)境。菊芋還具有極大的利用價值，國內(nèi)眾多單位已經(jīng)開展了關(guān)于菊芋的生物質(zhì)能源利用[1]、果聚糖代謝調(diào)控機理[2]、菊芋秸稈造紙[3]及飼草料加工應(yīng)用[4]等方面的研究。目前，國內(nèi)對于菊芋品種的選育主要是采用人工定向的方式，因此豐富的種質(zhì)資源必將是菊芋育種的先決條件。青海省農(nóng)林科學院菊芋研發(fā)中心歷經(jīng)十余年的育種研究，已經(jīng)審定通過了青芋1號、青芋2號、青芋3號3個菊芋品種[5-7]，是目前國內(nèi)審定品種最多的菊芋研發(fā)單位，已收集、保存國內(nèi)外菊芋資源400余份。

ISSR(Inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年發(fā)展起來的一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標記，目前已廣泛應(yīng)用于居群遺傳多樣性分析[8-9]、雜交后代鑒定[10-11]及分子生態(tài)學[12]研究中。在菊芋方面，本課題組已成功建立了菊芋ISSR-PCR擴增條件及程序,并篩選出了特異性好的引物，同時利用該技術(shù)對國內(nèi)青芋1號、2號、3號3個菊芋品種進行了快速鑒定[13-14]。因此，ISSR分子標記在菊芋方面的應(yīng)用已較為成熟，可以利用該技術(shù)研究不同來源的菊芋資源遺傳多樣性。

本研究從青海省農(nóng)林科學院菊芋研發(fā)中心種質(zhì)資源庫中挑選了40份國外菊芋種質(zhì)資源及國內(nèi)3個審定菊芋品種為供試材料，利用ISSR技術(shù)，對國外與國內(nèi)菊芋品種的親緣關(guān)系及遺傳多樣性進行了分析，旨在為菊芋種質(zhì)資源的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為40份國外菊芋資源與3個國內(nèi)審定菊芋品種(表1)，均種植于青海省農(nóng)林科學院菊芋研發(fā)中心資源圃內(nèi)。于2012-04選取幼嫩菊芋葉片,硅膠干燥后在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?3份菊芋資源分別于2012-10及2013-10采收時按照菊芋觀察記載標準進行統(tǒng)計。

表1 43份菊芋種質(zhì)資源及來源Table 1 43 Helianthus tuberosus L.and their exporting countries

1.2 方 法

試驗于2012-04-2013-09在青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室內(nèi)完成。

1.2.1 DNA提取與檢測 菊芋葉片DNA提取及檢測參照文獻[15]的方法進行。

1.2.2 引物篩選及PCR擴增 參照韓睿等[14]的菊芋 ISSR 引物篩選結(jié)果，從中選擇擴增條帶清晰、多態(tài)性好的14條引物進行PCR反應(yīng)。引物名稱及序列已在表2中列出。ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴增程序參照趙孟良等[13]的報道進行，PCR反應(yīng)體系(20 μL)包括：1.5 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L引物，1.0 UTaqDNA 聚合酶和50 ng模板DNA；PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸75 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

凝膠圖像用Image Lab 3.0軟件進行分析，電泳圖譜的每條帶(DNA片段)均為1個分子標記(Marker)，代表1個引物的結(jié)合位點。根據(jù)各分子標記的遷移率及其有無統(tǒng)計所有的二元數(shù)據(jù)，有帶(顯性)記作1，無帶(隱性)記為0，強帶和弱帶均賦值，根據(jù)0，1矩陣建立43個菊芋資源的DNA指紋圖譜。利用POPGENE32軟件計算多態(tài)位點比率(PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)。用NTSYS 2.10版軟件計算樣品間的相似系數(shù)，然后利用SAHN Clustering軟件的算術(shù)平均法(Unweighted pair-group method arithmetie average，UPGMA)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊芋資源的ISSR分子標記的多態(tài)性

由表2可知，14條引物對43份菊芋模板共擴增出位點203個，其中多態(tài)性位點199個，多態(tài)性位點比率(PPB)達到98.0%，引物847的多態(tài)位點比率最低，為91.7%；14條引物擴增的條帶數(shù)為9～18條，平均為14.5條，其中擴增條帶數(shù)最少的為引物844，只有9條。擴增片段長度大多為300～2 000 bp。引物844的擴增結(jié)果見圖1。

表2 基于14條引物的43份菊芋PCR擴增結(jié)果Table 2 PCR amplification of 43 Jerusalem artichoke varieties based on 14 primers

注：*Y 代表簡并堿基C 或者 T，R 代表簡并堿基A 或者 G。

Note：Y represents degenerate base C or T，and R represents degenerate base A or G.

由表3可知，供試的43份菊芋資源平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.894 8，平均Nei’s 基因多樣性指數(shù)為0.467 7，平均 Shannon’s信息指數(shù)為0.659 0。各位點遺傳多樣性程度也存在較大差異，Nei’s基因多樣性指數(shù)最大值為0.499，最小值為0.430 8。Shannon’s 信息指數(shù)最大值為0.693，最小值為0.308。

圖1 引物844對43份菊芋的PCR擴增結(jié)果M.DNA Marker DS5000；1～43.分別為表1中的43份菊芋資源；箭頭所示為多態(tài)性位點位置Fig.1 PCR amplification of 43 Jerusalem artichoke varieties based on primer 844 M.DNA Marker DS5000；1-43.the 43 of Helianthus tuberosus L.as in Table 1；The position indicated by arrows are polymorphism loci

表3 供試43份菊芋資源的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)Table 3 Nei’s gene diversity index and Shannon’s index of the tested 43 Jerusalem artichoke resources

續(xù)表3 Continued table 3

2.2 基于相似系數(shù)的供試菊芋資源ISSR聚類分析

以供試的43份菊芋資源擴增出的203個位點數(shù)據(jù)為原始矩陣，共獲得903個兩兩不同的遺傳相似系數(shù)，其中FA25與FA26的相似系數(shù)最大，為0.955，說明這2個菊芋資源親緣關(guān)系很近；FA2與青芋2號的相似系數(shù)最小，為0.443，說明二者親緣關(guān)系較遠。從聚類圖(圖2)可以看出，以0.64為閾值可以將供試菊芋資源分為2大類群。第Ⅰ類群：40份資源，均為國外資源(占所有資源的93.02%)，對其進一步分析，又可將第Ⅰ大類在閾值為0.784處分為7個亞類。第1亞類有30個資源，占第Ⅰ類群的75.0%；第2亞類有3個資源，分別是FA4、FA6和FA12，占第Ⅰ類群的7.5%；第3亞類有2個菊芋資源，分別是FA15和FA20，占第Ⅰ類群的5.0%；第4亞類有2個菊芋資源，分別是FD2和FD5，占第Ⅰ類群的的5.0%；第5亞類有1個菊芋資源，即FA5，占第Ⅰ類群的2.5%；第6亞類有1個菊芋資源，即FA7，占第Ⅰ類群的2.5%；第7亞類有1個菊芋資源，即FA9，占第Ⅰ類群的2.5%。第Ⅱ類群有3個菊芋品種，均為國內(nèi)審定品種，包括青芋1號、2號、3號3個菊芋品種。

由以上分類可知，國外40份菊芋資源與國內(nèi)3個菊芋品種之間的親緣關(guān)系較遠。同時，聚類圖顯示同一地區(qū)的種質(zhì)資源優(yōu)先聚在一起，如來自中國的青芋1號、2號、3號聚為一類，體現(xiàn)出一定的地域性。

2.3 不同類群菊芋種質(zhì)資源的形態(tài)學主要特點

在實際生產(chǎn)中，通常是通過觀察對比菊芋全生育期內(nèi)的植物學性狀，如株高、莖粗、葉形、塊莖形狀、塊莖顏色等來區(qū)分不同的菊芋資源，但最常用的最直觀的方法是通過塊莖的形狀及顏色來進行區(qū)分。因此本研究主要從塊莖形狀及顏色對菊芋種質(zhì)資源進行分析。

第1亞類30份菊芋種質(zhì)資源中塊莖形狀主要有紡錘形、球形、瘤狀3種，其中紡錘形的包括FA1、FA23、FD3、FD6、FD9、FD10、FD13 等7種，球形的包括FA2、FA3、FA8、FA11、FA14、FA17、FA18、FA19、FA25、FA26、FD1、FD4等12種，瘤狀的包括FA10、FA13、FA16、FA21、FA22、FA24、FA27、FD7、FD8、FD11、FD12等 11種；塊莖顏色主要有白色、紅色、紫色、褐色、白褐色5種，其中白色的包括FA1、FA3、FA8、FA10、FA13、FA16、FA17、FA18、FA21、FA22、FA23、FA24、FA25、FA26、FA27、FD4、FD7、FD8、FD12等19種，紅色的包括FA2、FA11、FA14、FD1 等4種，紫色的包括FD3、FD6 2種，褐色的包括FD13 1種，白褐色的包括FA19、FD9、FD10、FD11等 4種。第2亞類3份菊芋資源塊莖形狀：FA4與FA12為紡錘形，F(xiàn)A6為球形；塊莖顏色：FA4為紫紅色，F(xiàn)A6為白褐色，F(xiàn)A12為紅色。第3亞類的2份菊芋資源塊莖形狀：FA15為紡錘形，F(xiàn)A20為球形；塊莖顏色：FA15為白褐色，F(xiàn)A20為紅色。第4亞類中的2份菊芋資源塊莖形狀均為瘤狀，塊莖顏色均為白色。第5亞類中FA5塊莖為紡錘形，顏色為白色。第6亞類中FA7塊莖為棒狀，顏色為紅色。第7亞類中FA9塊莖為紡錘形，顏色為白褐色。

圖2 基于相似系數(shù)的43份菊芋資源的UPGMA聚類結(jié)果
Fig.2 Similarity coefficient based UPGMA clustering of the 43HelianthustuberosusL.resources

3 討 論

3.1 國外菊芋資源遺傳多樣性分析

豐富的菊芋種質(zhì)資源是菊芋育種的基礎(chǔ)，而探明親本材料的遺傳多樣性程度和親緣關(guān)系的遠近是育種的關(guān)鍵[16]。目前，ISSR標記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到種質(zhì)遺傳多樣性和遺傳差異檢測的研究中[17-18]。本試驗采用ISSR分子標記技術(shù)研究了國外40份菊芋資源與國內(nèi)3個菊芋品種之間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系。結(jié)果表明，供試的43份菊芋資源平均有效等位基因數(shù)為1.894 8，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.467 7，平均Shannon’s 信息指數(shù)為0.659 0；43份菊芋資源間的相似系數(shù)為0.443～0.955，說明ISSR標記技術(shù)完全能夠應(yīng)用于菊芋資源遺傳多樣性分析研究。

因此，根據(jù)本研究的結(jié)果，在今后菊芋育種過程中可以利用遺傳距離相對較遠的資源進行雜交，創(chuàng)制新的菊芋種質(zhì)。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，來源相同的菊芋資源如FA5、FA7和FA9單獨聚為一類，下一步可以通過增加ISSR引物、優(yōu)化試驗條件來深入探討這些菊芋資源間的遺傳多樣性[19]。

3.2 菊芋遺傳距離與地理距離的相關(guān)性

國外40份菊芋資源與國內(nèi)的3個菊芋資源間的遺傳距離較國內(nèi)品種間的遺傳距離大，具有較高的遺傳多樣性，其中部分資源可以作為新的育種材料加以利用。另外，各供試材料在種質(zhì)遺傳距離與來源地的關(guān)系上表現(xiàn)出了很強的相關(guān)性，聚類結(jié)果顯示，國內(nèi)與國外菊芋種質(zhì)資源未聚為一類，說明國外菊芋資源與國內(nèi)菊芋品種親緣關(guān)系較遠。

3.3 菊芋聚類結(jié)果與形態(tài)學分類結(jié)果的差異

對40份國外菊芋資源的聚類分析結(jié)果與根據(jù)形態(tài)性狀進行分類的結(jié)果部分吻合，說明二者具有一定的相關(guān)性[20]。供試的一部分菊芋資源從形態(tài)學上分類不屬于一類，但是在基于ISSR 標記的聚類分析中被劃分到同一類中，例如第Ⅰ大類中的第2亞類FA6與FA12，二者塊莖形狀一致但顏色不同，在基于ISSR標記分析的聚類樹狀圖中二者親緣關(guān)系較近并聚在一起，在第1亞類中同樣有類似的情況出現(xiàn)。這一方面說明傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法不能完全反映出菊芋資源間的親緣關(guān)系，必須結(jié)合分子標記等其他生物學方法進行完善；另一方面說明可以適當增加ISSR引物做進一步的篩選分析。

本研究首次利用ISSR分子標記技術(shù)對來自國外的菊芋群體資源與國內(nèi)審定的3個菊芋品種進行了親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，國內(nèi)與國外菊芋資源間遺傳關(guān)系較遠，且國外資源間存在豐富的遺傳多樣性。因此，在今后的育種工作中可以依據(jù)遺傳多樣性分析和聚類結(jié)果進行親本選擇，避免人力物力資源的浪費，為后續(xù)菊芋資源的可持續(xù)性開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

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ISSR based genetic diversity of 43HelianthustuberosusL.

ZHAO Meng-liang,SUN Xue-mei,WANG Li-hui，LI Li

(ResearchandDevelopmentCenterofJerusalemArtichoke,QinghaiKeyLaboratoryofVegetableGeneticsandPhysiology,QinghaiAcademyofAgricultureandForestry,Xining,Qinghai810016,China)

【Objective】 This study aimed to clarify genetic relationship and genetic diversity of Jerusalem artichoke resources at home and abroad. 【Method】 A total of 40 foreignHelianthustuberosusL. resources and 3 domestic varieties were used as experimental material,and 14 primers were adopted for ISSR molecular marker analysis to analyze their genetic diversity.POPGENE32 software was used to calculate ratio of polymorphic loci (PPB),effective number of alleles (Ne),Nei’s genetic diversity index (H),and Shannon’s information index (I) while NTSYS 2.10 software was used to calculate similarity coefficient between varieties,conduct clustering analysis,and analyze the morphological characteristics of different groups.【Result】 A total of 203 marks were obtained when using 14 primers to amplify the 43 Jerusalem artichoke resources by PCR amplification.199 polymorphism markers were polymorphic markers with the polymorphism rate of 98.0%.POPGENE32 software analysis showed that averaged effective number of alleles,Nei’s genetic diversity index,and Shannon’s information index,of the 43HelianthustuberosusL.resources were 1.894 8,0.467 7,and 0.659 0,respectively,while NTSYS showed that and the similarity coefficient was 0.443 to 0.955.Clustering analysis showed that 43HelianthustuberosusL.【Conclusion】 The genetic relationship ofHelianthustuberosusL.resources between domestic and abroad was far,and the foreign resources had abundant genetic diversity.

HelianthustuberosusL.;germplasm resources;ISSR;genetic diversity

時間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.021

2014-03-05

農(nóng)業(yè)部“948”項目(2013-Z72)；青海省科技廳基礎(chǔ)研究項目(2012-H-809)

趙孟良(1986-)，男，河南商丘人，碩士，助理研究員，主要從事菊芋遺傳育種及生理生化研究。 E-mail：zhaomengliang@qhu.edn.cn

李 莉(1959-)，女，江蘇豐縣人，研究員，碩士生導師，主要從事蔬菜遺傳育種及栽培生理研究。 E-mail：yyslili@163.com

S330

A

1671-9387(2015)09-0150-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.042.html