繆曉娟，楊 慧，孫浩平，付 利，范方毅，王 譯，何光翠，賴思含，侯嚴(yán)堂，李業(yè)成，易 海，蘇 毅

(成都軍區(qū)總醫(yī)院血液科，成都 610083)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

EBV-CTL治療異基因造血干細(xì)胞移植后難治性EB病毒感染的分析*

繆曉娟，楊 慧，孫浩平，付 利，范方毅，王 譯，何光翠，賴思含，侯嚴(yán)堂，李業(yè)成，易 ?！?，蘇 毅

(成都軍區(qū)總醫(yī)院血液科，成都 610083)

目的研究EB病毒特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(EBV-CTL)治療異基因造血干細(xì)胞移植后難治性EBV感染的療效。方法報(bào)道4例EBV-CTL治療異基因造血干細(xì)胞移植后難治性EBV感染病例并結(jié)合文獻(xiàn)分析。結(jié)果3例取得了較好療效，分別于治療后1、2、3個(gè)月轉(zhuǎn)陰，分別隨訪8、12、6個(gè)月未復(fù)發(fā)，僅有1例在EBV-DNA轉(zhuǎn)陰后第6個(gè)月復(fù)發(fā)，再次EBV-CTL治療后，迅速進(jìn)展為移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病(PTLD)，治療無(wú)效死亡。結(jié)論EBV-CTL是治療難治性EBV感染的一種有效手段，但仍有部分病例治療無(wú)效，值得進(jìn)一步探討和研究。

皰疹病毒4型，人；特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞；異基因造血干細(xì)胞移植

EB病毒(EBV)感染是異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)后常見并發(fā)癥，通常采用減停免疫抑制劑、抗病毒藥物和CD20單克隆抗體(利妥昔單抗)治療，部分病例病情可以得到有效控制，但仍有部分病例病情進(jìn)展，成為難治性EBV感染，甚至可發(fā)展成移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病(post-transplantlymphoproliferativedisease，PTLD)[1]。因此，如何治療常規(guī)治療無(wú)效的難治性EBV感染仍是亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)EBV特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(EBV-CTL)為這一感染提供了新的治療手段[2]。本文采用EBV-CTL治療4例allo-HSCT后難治性EBV感染，獲得了較好的療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2014年12月共4例患者，其中男1例，女3例；平均年齡(14.0±11.6)歲；1例再生障礙性貧血，2例復(fù)發(fā)難治急性髓系白血病，1例復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病。

1.2 EBV-CTL的制備方法 主要試劑與儀器：RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細(xì)胞介素(rhIL)4、rhIL-7、rhIL-12、rhIL-15購(gòu)于PEPROTECH公司，rhIL-2購(gòu)于江蘇金絲利公司，淋巴分離液(Ficoll1.077)購(gòu)于天津斯坦姆生物科技有限公司，PepMix.EBV購(gòu)于JPT公司，PGE2購(gòu)于SIGMA公司，血細(xì)胞分離機(jī)購(gòu)于費(fèi)森尤斯公司。制備方法：(1)常規(guī)使用血細(xì)胞分離機(jī)分離血細(xì)胞懸液。(2)將分離好的血細(xì)胞懸液與生理鹽水按照1∶1等量混勻，2 000 r/min離心15 min，棄去上清液。(3)抽取適量淋巴分離液(Ficoll1.077)，將棄去上清液的細(xì)胞液與生理鹽水按照1∶1等量混勻，再緩緩加入Ficoll上層，2 000 r/min離心20 min。(4)棄上清液，收集PBMC層液至離心管中，加入生理鹽水30 mL混勻，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，重復(fù)3次后計(jì)數(shù)。(5)用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞于75 cm2培養(yǎng)瓶，放置37 ℃，5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，將懸浮細(xì)胞(制備CTL)與貼壁細(xì)胞(制備DC)分開培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞內(nèi)加入rhIL-2、rhIL-15、rhIL-7、rhIL-12，貼壁細(xì)胞內(nèi)加入GM-CSF、rhIL-4。D6：DC內(nèi)加入PGE2，D7：DC內(nèi)加入Pepmix.EBV，4 h后加入CTL中并繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，后收集細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，并做流式檢測(cè)，輸注前常規(guī)進(jìn)行微生物學(xué)送檢，確保無(wú)污染后輸注患者。

1.3 EBV-CTL輸注 輸注CTL前給予地塞米松2.5 mg靜推；EBV-CTL輸注總量為(5.0～11.5)×106/kg，輸注時(shí)間為0.5 h，共4 d，1次/月。

1.4 患者隨訪 監(jiān)測(cè)EBV-DNA定量(通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)外周血EBV-DNA，拷貝數(shù)小于103為陰性)，1次/2周。

2 結(jié) 果

2.1 EBV-CTL制備產(chǎn)品的檢測(cè) 采用流式分析所得EBV-CTL CD3+細(xì)胞中位數(shù)為92.9%(88.4%～94.6%)，其中CD8+細(xì)胞占83.6%(76.5%～95.2%)，CD4+細(xì)胞占8.8%(2.6%～11.7%)，而CD56+的NK細(xì)胞占6.3%(3.2%～10.9%)，CD19+的B細(xì)胞占0.4%(0.2%～0.8%)。

2.2 治療結(jié)果 病例1，女，7歲。診斷：重型再生障礙性貧血。移植前外周血EBV情況：陰性。預(yù)處理方案：氟達(dá)拉濱+ATG+環(huán)磷酰胺。移植方式：母供女(7/10)半相合allo-HSCT。移植后給予常規(guī)口服環(huán)孢素預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)。84 d后，患者出現(xiàn)反復(fù)低熱，體溫38 ℃左右，伴咳嗽咳痰，外周血查EBV-DNA定量：4.23×104copy/mL，考慮移植后EBV感染。立即將環(huán)孢素減量，給予阿昔洛韋200 mg 8 h 1次靜脈滴注及人免疫球蛋白5 g 每周1次靜脈滴注，2周后無(wú)好轉(zhuǎn)，給予利妥昔單抗(美羅華)100 mg靜脈滴注 1次/周，4周后患者仍間斷低熱，咳嗽咳痰癥狀無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，復(fù)查EBV-DNA進(jìn)行性升高至2.35×105copy/mL?？紤]為難治性EBV感染，給予EBV-CTL治療1次/月，輸注1次后患者體溫基本恢復(fù)正常，咳嗽咳痰基本緩解，EBV-DNA明顯下降，輸注第2次后，EBV-DNA轉(zhuǎn)為陰性。該例患者隨訪13個(gè)月，EBV-DNA始終為陰性。

病例2，女，31歲。診斷：復(fù)發(fā)難治性急性髓系白血病(M5型)。移植前外周血EBV情況：陰性。預(yù)處理方案：白消安+環(huán)磷酰胺+氟達(dá)拉濱+ATG。移植方式：父供女(5/10)半相合allo-HSCT。移植后給予口服環(huán)孢素預(yù)防GVHD，出現(xiàn)血壓升高、伴眼痛及頭痛，故改用他克莫司口服預(yù)防GVHD。56 d之后，外周血查EBV-DNA：2.22×103copy/mL。將他克莫司減量，給與阿昔洛韋350 mg 8 h 1次靜脈滴注及人免疫球蛋白10 g 1次周靜脈滴注，2周后EBV-DNA進(jìn)行性升高，故給予美羅華500 mg靜脈滴注1次/周，4周后復(fù)查EBV-DNA進(jìn)行性升高至7.84×103copy/mL?？紤]為難治性EBV感染，給予EBV-CTL治療1次/月，輸注1次后EBV-DNA轉(zhuǎn)為陰性。該例患者隨訪至今已8個(gè)月，EBV-DNA始終為陰性。

病例3，男，12歲。診斷：復(fù)發(fā)難治性急性淋巴細(xì)胞白血病(L2型)。移植前外周血EBV情況：陰性。預(yù)處理方案：白消安+環(huán)磷酰胺+氟達(dá)拉濱+ATG。移植方式：父供子(6/10)半相合allo-HSCT。移植后給予口服環(huán)孢素預(yù)防GVHD。34 d之后，患兒出現(xiàn)發(fā)熱，體溫39 ℃左右，伴咳嗽咳痰、呼吸困難，EBV-DNA定量：1.52×105copy/mL。肺CT提示雙肺彌漫磨玻璃樣改變，考慮移植后EBV感染。立即停用環(huán)孢素，給予膦甲酸鈉300 mg 1/天靜脈滴注及人免疫球蛋白10 g 1次/周靜脈滴注，2周后患者體溫?zé)o明顯下降，呼吸困難進(jìn)行性加重，復(fù)查EBV-DNA定量：7.81×105copy/mL。給予美羅華400 mg靜脈滴注1次/周，4周后患者體溫仍無(wú)明顯下降，呼吸困難進(jìn)行性加重，復(fù)查EBV-DNA進(jìn)行性升高至1.42×106copy/mL?？紤]為難治性EBV感染，給予EBV-CTL治療1次/月，輸注2次后患者體溫逐漸恢復(fù)正常，呼吸困難癥狀逐漸緩解。輸注第4次后EBV-DNA轉(zhuǎn)為陰性。該例患者隨訪至第10個(gè)月時(shí)，再次出現(xiàn)發(fā)熱，體溫38 ℃左右，伴咳嗽咳痰，EBV-DNA 6.20×105copy/mL?？紤]EBV感染復(fù)發(fā)。再次給予EBV-CTL治療2次后，患者體溫及呼吸道癥狀進(jìn)行性加重，且出現(xiàn)雙側(cè)頸部及腋窩淋巴結(jié)無(wú)痛性腫大，大者約2 cm×3 cm，疾病進(jìn)展為PTLD。給予美羅華聯(lián)合EBV-CTL治療后，患者病情繼續(xù)進(jìn)展，最終因多器官功能衰竭死亡。

圖1 4例患者輸注EBV-CTL后外周血EBV-DNA變化曲線

病例4，女，6歲。診斷：復(fù)發(fā)難治性急性髓系白血病(M2型)。移植前外周血EBV情況：陰性。預(yù)處理方案：白消安+環(huán)磷酰胺+氟達(dá)拉濱+ATG。移植方式：非血緣全相合allo-HSCT。移植后靜滴環(huán)孢素預(yù)防GVHD，患者出現(xiàn)抽搐、失語(yǔ)、意識(shí)短暫?jiǎn)适?，考慮環(huán)孢素所致，改用他克莫司小劑量口服預(yù)防GVHD。23 d之后，患兒低熱，頸部可觸及數(shù)個(gè)黃豆大串珠樣排列狀腫大淋巴結(jié)。EBV-DNA：5.23×103copy/mL。外周血(流式法)PTLD篩查：B細(xì)胞占有核細(xì)胞2.28%，Kappa/Lambda比值偏高，其中0.46%(占有核細(xì)胞)可疑為單克隆B細(xì)胞?？紤]：(1)EBV感染；(2)PTLD可疑。立即停用他克莫司，給予阿昔洛韋200 mg 1/8 h及人免疫球蛋白10 g 1次/周抗病毒治療，2周后無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，給予美羅華100 mg靜脈滴注1次/周，4周后，患兒仍偶有低熱，伴咳嗽咳痰，頸部淋巴結(jié)無(wú)明顯縮小，復(fù)查EBV-DNA進(jìn)行性升高至2.34×105copy/mL。給予EBV-CTL治療1次后，患兒體溫恢復(fù)正常，EBV-DNA下降，治療3次后，患兒頸部淋巴結(jié)縮小，EBV-DNA轉(zhuǎn)陰。該病例隨訪至今已6個(gè)月，EBV-DNA始終為陰性。

4例患者使用EBV-CTL治療后的EBV-DNA具體變化見圖1。

3 討 論

EBV感染是allo-HSCT后特別是接受T細(xì)胞去除移植物或免疫重建延遲的患者常見并發(fā)癥之一。van Esser等[3]報(bào)道EBV再激活發(fā)生率在非去除T細(xì)胞的移植患者中為31.0%，而在去除T細(xì)胞移植的患者中為65.0%。曹新輝等[4]報(bào)道allo-HSCT后EBV再激活的累積發(fā)生率42.27%，EBV再激活發(fā)生的危險(xiǎn)因素有HLA配型不合、應(yīng)用抗胸腺細(xì)胞球蛋白、Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病及年齡小于20歲。

根據(jù)2008年歐洲移植-感染會(huì)議制定的指南定義：在血液中檢測(cè)出EBV-DNA，且無(wú)臨床癥狀的患者可診斷為EBV血癥。部分EBV感染的患者最終可發(fā)展成嚴(yán)重致死性疾病PTLD，死亡率極高。PTLD最常見的臨床表現(xiàn)是發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大，其他還包括肝脾腫大、咽炎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等。

EBV感染主要治療措施有：(1)免疫抑制劑減量，是治療EBV血癥的首選方法。而對(duì)于HSCT后EBV感染患者，因?yàn)槊庖吖δ苌形粗亟?，減停免疫抑制劑并不能恢復(fù)T細(xì)胞功能，并有可能誘發(fā)嚴(yán)重GVHD[1,5]。(2)抗病毒治療，但抗病毒藥物是否能夠降低PTLD危險(xiǎn)性并不確定。(3)抗CD20單克隆抗體(利妥昔單抗)。PTLD患者B淋巴細(xì)胞穩(wěn)定高表達(dá)CD20抗原，為單克隆抗體治療提供理想靶點(diǎn)。美羅華常規(guī)劑量為375 mg/m2，每周1次，一般1個(gè)療程不超過(guò)4次。大部分患者在接受利妥昔單抗治療后，血液中EBV-DNA定量水平可出現(xiàn)大幅下降。Milpied等[6]報(bào)道，應(yīng)用美羅華治療32例PTLD患者，患者年齡3～67歲：20例患者取得了完全緩解，2例取得部分緩解，有效率達(dá)68.75%；其中6例骨髓移植患者中5例完全緩解，完全緩解率為83.00%。盡管利妥昔單抗具有良好的安全性，但它會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞6～8個(gè)月的缺乏以及一些未知的長(zhǎng)期的不良反應(yīng)[7]。雖然罕見，使用利妥昔單抗導(dǎo)致CD20陰性淋巴瘤的復(fù)發(fā)已報(bào)道[8]。

EBV原發(fā)感染后，EBV潛伏于B細(xì)胞中，能啟動(dòng)細(xì)胞增殖程序，最終可發(fā)展為惡性增殖的淋巴組織。在正常人體內(nèi)，T細(xì)胞可控制B細(xì)胞增殖從而阻止這一進(jìn)程的發(fā)生。當(dāng)感染EBV的宿主是已接受allo-HSCT的患者時(shí)，由于該類患者免疫功能低下，并缺乏有效的免疫監(jiān)視，可導(dǎo)致EBV出現(xiàn)再激活，病毒大量復(fù)制，同時(shí)大量表達(dá)EBV相關(guān)基因，其中一些癌基因可引起B(yǎng)細(xì)胞異常增生，最終可能發(fā)展為PTLD[9-10]。而EBV-CTL通過(guò)過(guò)繼細(xì)胞免疫，可重建T細(xì)胞免疫反應(yīng)，不僅可直接清除受感染B淋巴細(xì)胞，抑制B淋巴細(xì)胞擴(kuò)增治療PTLD，還可以產(chǎn)生長(zhǎng)期記憶效應(yīng)，防止疾病復(fù)發(fā)。Bollard等[11]報(bào)道了一項(xiàng)為期7年的臨床研究，56例患者年齡9個(gè)月至20歲，均行去T細(xì)胞HSCT，所有患者預(yù)防性輸注了供者來(lái)源的EBV-CTL；輸注CTL的中位時(shí)間為移植后88 d，其中26例輸注的CTL標(biāo)記有新霉素抵抗基因；56例患者均未發(fā)生PTLD，而對(duì)照組的PTLD發(fā)生率為11.50%；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)患者外周血中新霉素抵抗基因持續(xù)時(shí)間最短為69個(gè)月；有3例因不適合預(yù)防性輸注而發(fā)展為PTLD的患者，接受了EBV-CTL輸注治療，2例患者病情得以緩解，治療無(wú)效的患者淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了抗原逃逸變異。Heslop等[12]進(jìn)行的一項(xiàng)單中心研究中，114例患者在接受HSCT后使用供者來(lái)源的EBV-CTL進(jìn)行預(yù)防或治療PTLD，結(jié)果顯示，所有患者均可很好地耐受治療，無(wú)一例患者在輸注淋巴細(xì)胞后發(fā)生GVHD。其中101例血清EBV-DNA陽(yáng)性的患者，最終沒(méi)有發(fā)展為PTLD，而11例疑似PTLD患者治療后均達(dá)到完全緩解，并且無(wú)復(fù)發(fā)。

結(jié)合本研究這4個(gè)病例，發(fā)生EB病毒感染后，先后給予了抗病毒藥物、人免疫球蛋白、利妥昔單抗(美羅華)治療，均未取得療效，發(fā)展成難治性EBV感染。給予EBV-CTL后，4例患者中，其中3例取得了較好療效，僅有1例患者在EBV-DNA轉(zhuǎn)陰后第6個(gè)月復(fù)發(fā)，在EBV-CTL治療后，迅速進(jìn)展為PTLD治療無(wú)效死亡。4例患者無(wú)一例出現(xiàn)治療相關(guān)不良反應(yīng)或GVHD。

綜上所述，EBV-CTL是治療常規(guī)治療無(wú)效的EBV感染的一種有效手段，為難治性EBV感染提供了新的治療策略。部分病例反應(yīng)良好，但在長(zhǎng)期隨訪過(guò)程中仍有部分病例EBV-DNA再次升高，再次給予美羅華及EBV-CTL治療仍然無(wú)效，最終發(fā)展為PTLD，治療無(wú)效死亡，說(shuō)明EBV-CTL治療移植后難治性EBV感染仍然有很多未解之謎。本研究雖然取得了一定療效，但因病例數(shù)較少，后期仍需擴(kuò)大病例數(shù)量，對(duì)該方法進(jìn)行進(jìn)一步探討和研究。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.007

成都軍區(qū)總醫(yī)院院管項(xiàng)目(2013YG-B045)。

：繆曉娟(1985-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事血液方面的研究。△

，Tel:13699418229；E-mail:yihaimail@163.com。

R457.7

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1671-8348(2015)29-4051-03

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2015-06-19)