楊 易，劉健翔，李紅巖，黃海霞，史云龍，劉永明，蘇何玲

(桂林醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，廣西桂林 541100)

·論 著·

乙型肝炎病毒前S2蛋白激活人酰基蛋白硫酯酶1啟動子*

楊 易，劉健翔，李紅巖，黃海霞，史云龍，劉永明△，蘇何玲▲

(桂林醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，廣西桂林 541100)

目的探討乙型肝炎病毒(HBV)前S2蛋白(preS2)對人酰基蛋白硫酯酶1(APT1)啟動子的作用。方法生物信息學方法確定人APT1啟動子序列。PCR擴增人APT1啟動子和HBV preS2基因，分別插入pGL3和pcDNA3.1(-)質(zhì)粒構(gòu)建人APT1啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-APT1和HBV preS2真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-preS2。將pGL3-APT1和pcDNA3.1(-)-preS2共轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系HepG2，然后通過檢測細胞熒光素酶活性來評價preS2對人APT1基因啟動子的作用。數(shù)據(jù)用獨立樣本t檢驗分析。結(jié)果測序結(jié)果證實pcDNA3.1(-)-preS2與pGL3-APT1與實驗設計相符。pGL3-APT1的熒光素酶活性是陽性對照質(zhì)粒pGL3-Control的熒光素酶活性的1.2倍(P<0.01)。pcDNA3.1(-)-preS2與pGL3-APT1共轉(zhuǎn)染HepG2細胞的熒光素酶活性為無preS2基因質(zhì)粒pcDNA3.1(-)與pGL3-APT1共轉(zhuǎn)染HepG2細胞熒光素酶活性的2.6倍(P<0.01)。結(jié)論本研究克隆的人APT1啟動子序列具有高啟動子活性；HBV preS2可激活人APT1啟動子。

肝炎病毒,乙型;病毒蛋白類；蛋白質(zhì)前體；?；鞍琢蝓ッ?；啟動子；反式激活

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球性公共衛(wèi)生問題，慢性HBV感染人群超過2.4億，每年約有78萬人死于因HBV感染所導致的相關疾病[1]。大量的研究表明，HBV編碼的多種蛋白具有反式轉(zhuǎn)錄激活功能。這些病毒反式調(diào)節(jié)因子在HBV感染所致的炎性反應乃至肝細胞癌發(fā)生的過程中發(fā)揮著關鍵的作用[2-3]。HBV前S2蛋白(preS2)是重要的HBV反式調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)原癌基因、端粒酶及一氧化氮合酶等基因的表達，其反式轉(zhuǎn)錄激活作用影響宿主細胞生長、信號轉(zhuǎn)導、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生等生理、病理過程[4-5]。近年來，?；鞍琢蝓ッ?(acyl protein thioesterase 1，APT1)因其參與蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀恼{(diào)節(jié)而受到重視。棕櫚?；揎検堑鞍踪|(zhì)完成翻譯后脂質(zhì)共價修飾的一種重要形式，廣泛存在于生物體內(nèi)，在代謝、凋亡、細胞內(nèi)信號的傳導以及疾病的發(fā)生發(fā)展等環(huán)節(jié)中都起著非常重要的作用[6-8]。蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀闹饕愋褪荢 型棕櫚酰化修飾，即16 個碳的飽和棕櫚酸鹽以硫酯鍵形式共價結(jié)合到半胱氨酸殘基的巰基上。APT1是棕櫚?；鞍兹型棕櫚酰化修飾的主要水解酶，在蛋白質(zhì)可逆性棕櫚酰化修飾中發(fā)揮關鍵作用[9]。目前尚不清楚preS2對APT1基因表達的影響。本研究構(gòu)建APT1啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒和HBV的preS2真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系HepG2，以觀察preS2對APT1啟動子的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 乙型肝炎患者血清及全血由廣西壯族自治區(qū)桂林市第三人民醫(yī)院提供。HepG2細胞由解放軍302醫(yī)院饋贈，高糖DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素及青霉素及胰酶均購自美國Gibco公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、KpnI及XhoI購自上海生物工程有限公司，熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3系列載體和T-easy試劑盒購自美國Promega公司，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司。測序均由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1(-)-preS2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù) HBV 基因組全序列(GenBank accession No.AF384371)，設計引物擴增preS2基因，引物兩端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點序列，上游引物為：5′-GAA TTC CAA TGC AGT GGA ACT CCA CC-3′,下游引物為：5′-GGA TCC GTT CGG TGC AGG GTC-3′。提取乙型肝炎患者血清中的HBV為模板，PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。將PCR產(chǎn)物克隆入 pGEM?-T Easy 載體，EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切后裝入 pcDNA3.1(-) 載體中構(gòu)建 pcDNA3.1(-)-preS2 重組質(zhì)粒，并測序鑒定其序列。

1.2.2 APT1啟動子雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 在http://dbtss.hgc.jp/ 數(shù)據(jù)庫中查尋人APT1基因(GenBank accession No.NM_006330)轉(zhuǎn)錄起始位點，選取轉(zhuǎn)錄起始點上游1 500 bp核苷酸及轉(zhuǎn)錄起始點下游100 bp核苷酸序列，以Berkeley Drosophila Genome Project(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)數(shù)據(jù)庫在線預測其啟動子，根據(jù)軟件預測的分值及與轉(zhuǎn)錄起始點的相對位置，設計引物擴增-1 164～+67 bp的片段，并在引物的兩端加上KpnI 和XhoI 酶切位點，APT1上游引物為：5′-GGG GTA CCC ACC GTG TTA AGG CAG GAT G-3′， APT1下游引物為：5′-CCG CTC GAG CCC CGC GCT ACC TTC CG CGC-3′。以人外周血中的DNA為模板，PCR反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個循環(huán)；72℃ 延伸 5 min。將擴增的APT1啟動子序列克隆入pGL3質(zhì)粒中構(gòu)建pGL3-APT1啟動子雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒。

1.2.3 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測 以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)HepG2細胞，轉(zhuǎn)染前1 d以細胞2×105個/孔接種于24孔板。以LipofectamineTM2000為轉(zhuǎn)染試劑，將無內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中，所有轉(zhuǎn)染均同時轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶報告基因質(zhì)粒 pRL-TK 作為內(nèi)參照，以較正熒光。轉(zhuǎn)染48 h后，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書裂解細胞、檢測熒光。

1.2.4 pGL3- APT1 啟動子活性檢測 設立空白對照(即未轉(zhuǎn)染組)，分別將無啟動子質(zhì)粒 pGL3-Basic、陽性啟動子質(zhì)粒pGL3-Control及 APT1啟動子質(zhì)粒 pGL3- APT1轉(zhuǎn)染至HepG2 細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，裂解細胞、檢測熒光，以測定所構(gòu)建的 pGL3- APT1 啟動子雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒中 APT1 基因啟動子的活性。

1.2.5 preS2與 APT1 基因啟動子的相互作用檢測 以pcDNA3.1(-) 與 pGL3-Basic Vector 共轉(zhuǎn)染組，pcDNA3.1(-) 與 pGL3-Control Vector共轉(zhuǎn)染組， pcDNA3.1(-) 與 pGL3 - APT1 共轉(zhuǎn)染組為對照，pcDNA3.1(-)-preS2與pGL3-APT1共轉(zhuǎn)染組為實驗組，轉(zhuǎn)染HepG2細胞并檢測報告熒光，以檢測前S2蛋白對APT1 基因啟動子的作用。

2 結(jié) 果

2.1 pcDNA3.1(-)-preS2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用PreS2基因引物擴增出的DNA片段大小與預期相符，將其克隆入 pcDNA3.1(-) 載體中構(gòu)建pcDNA3.1(-)-preS2重組質(zhì)粒，測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒構(gòu)建與實驗設計相符。

2.2 APT1啟動子雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 Berkeley Drosophila Genome Project數(shù)據(jù)庫在線預測提示在APT1基因的-1 303～-1 247 bp、-888～-837 bp、-93～-43 bp、-4～+47 bp及+39～+89 bp出現(xiàn)了5個可能的啟動子序列，其分值分別為：0.69、0.96、0.68、0.63、0.63.根據(jù)軟件預測的分值及與轉(zhuǎn)錄起始點的相對位置，選取包括-888～-837 bp、-93～-43 bp及-4～+47bp的序列在內(nèi)的一段APT1基因序列作為其啟動子。設計引物擴增-1 164～+67 bp的片段，所設計的APT1啟動子引物擴增出的DNA片段大小與預期相符，將其克隆入pGL3啟動子雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒，將獲得的重組質(zhì)粒pGL3- APT1送上海生物工程公司測序列，其結(jié)果證實重組質(zhì)粒構(gòu)建與實驗設計相符。

2.3 pGL3-APT1啟動子活性檢測 熒光素酶活性檢測提示，陰性對照pGL3-Basic Vector組無熒光素酶表達，細胞裂解液中熒光素酶的活性接近空白對照；陽性對照pGL3-Control組正常表達熒光素酶，其熒光素酶的活性為 pGL3-Basic組的5.1倍；pGL3-APT1組正常表達熒光素酶，其熒光素酶的活性為pGL3-Basic組6.1倍；略高于pGL3-Control組，表明pGL3-APT1中APT1的啟動子具較強的啟動子活性，見圖1。

1：空白對照組(即未轉(zhuǎn)染組)；2:pGL3-Basic組；3:pGL3-Control組；4:pGL3-APT1組。

圖1 pGL3-APT1 啟動子活性檢測結(jié)果

1:pcDNA3.1(-) 與 pGL3-Basic Vector 共轉(zhuǎn)染對照組；2:pcDNA3.1(-) 與 pGL3-Control Vector共轉(zhuǎn)染對照組；3:pcDNA3.1(-) 與 pGL3 - APT1 共轉(zhuǎn)染對照組；4:pcDNA3.1(-)-preS2與pGL3-APT1共轉(zhuǎn)染實驗組。

圖2 HBV PreS2與APT1基因的啟動子的相互作用檢測結(jié)果

2.4 HBV PreS2與APT1基因的啟動子的相互作用檢測 熒光素酶活性檢測提示，pcDNA3.1(-)-preS2與pGL3-APT1共轉(zhuǎn)染實驗組、pcDNA3.1(-) 與pGL3-APT1共轉(zhuǎn)染對照組、pcDNA3.1(-) 與 pGL3-Control Vector共轉(zhuǎn)染對照組均有熒光素酶表達，而pcDNA3.1(-)與pGL3-Basic Vector共轉(zhuǎn)染對照組無熒光素酶表達。其中pcDNA3.1(-)-preS2與pGL3 - APT1共轉(zhuǎn)染實驗組熒光素酶活性最高，為pcDNA3.1(-)與pGL3-APT1共轉(zhuǎn)染對照組的2.6倍，顯示preS2激活APT1啟動子，見圖2。

3 討 論

由于HBV是具有泛嗜性感染的病毒，其感染的受累器官并不限于肝臟。因此，盡管preS2的反式調(diào)節(jié)作用已有大量的報道，但其對人體多種細胞、許多基因的作用以及由此產(chǎn)生的細胞生理病理變化仍待研究。

有研究指出，preS2激活一種具有磷脂?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的蛋白，即preS2反式激活蛋白1的基因[10]，提示其可能參與細胞的磷脂代謝，影響細胞的磷脂信號分子水平。本研究的前期工作克隆了人親磷脂酸磷脂酶A1(phosphatidic acid-preferring phospholipase A1,PA-PLA1)2種亞型基因(GenBank accession no.DQ315474和GU376468)。PA-PLA1在細胞內(nèi)對磷脂酸進行水解，生成溶血磷脂酸。對小鼠分泌胰島素細胞株MIN6行不同濃度和不同時間的葡萄糖刺激胰島素分泌實驗，結(jié)果顯示MIN6細胞PA-PLA1基因的表達與胰島素分泌呈正相關[11]，沉默PA-PLA1基因可致胰島素分泌降低[12]。此外，preS2可作用于胰島素受體基因而下調(diào)胰島素受體基因的表達[13]。這些研究結(jié)果提示，preS2可能在乙型肝炎并發(fā)糖尿病的發(fā)病、發(fā)展中發(fā)揮作用。

本研究觀察preS2對人APT1啟動子的作用。APT1是具有硫酯酶活性和磷脂酶活性的酶，因而也被稱為APT1/溶血磷脂酶A1。APT1主要定位于細胞質(zhì)，能對多種細胞生物學過程發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。一方面，APT1通過其硫酯酶活性參與蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾的調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾是一個可逆的過程，由蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶和硫酯酶雙重調(diào)控。蛋白質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶使蛋白質(zhì)棕櫚?；瑢е碌鞍踪|(zhì)的疏水性增加，在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和定位過程中起到重要作用，同時使蛋白質(zhì)的生理功能多樣化[14]。而硫酯酶中APT1水解棕櫚酰基使S型棕櫚?；鞍兹プ貦磅；揎?。另一方面，APT1還通過其磷脂酶活性調(diào)節(jié)溶血磷脂水平。溶血磷脂是活躍的脂類信號分子，可通過其特異的 G 蛋白耦聯(lián)受體，在血小板激活、胰島素分泌、細胞增殖以及肌動蛋白細胞骨架的重構(gòu)等細胞過程中發(fā)揮關鍵調(diào)節(jié)作用[15-17]。目前還不清楚preS2對APT1基因的作用以及由此產(chǎn)生的對包括胰島素分泌在內(nèi)的細胞生理生化過程的影響。因此，探討preS2對APT1啟動子的作用，明確preS2對APT1基因表達的影響，將有助于闡明HBV感染導致的疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制。

應用生物信息學方法預測、分子克隆技術(shù)獲得的人APT1啟動子經(jīng)啟動子活性檢測顯示其活性與陽性對照啟動子活性相同，甚至略高。這一結(jié)果表明本研究所克隆的人啟動子序列具有很強的啟動子活性。目前鮮有人APT1啟動子功能的研究報道，該APT1啟動子的克隆將為深入研究APT1在細胞的諸多生理和病理過程中的作用奠定實驗基礎。

HBV preS2真核表達質(zhì)粒和人APT1啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞的實驗結(jié)果表明，preS2可激活人APT1啟動子，因而提示preS2可上調(diào)APT1基因的表達。鑒于APT1參與機體多種細胞生物學過程，preS2對APT1啟動子的激活作用意味著該病毒蛋白通過增加APT1的表達水平而對機體產(chǎn)生復雜的生理和病理影響。

綜上所述，本研究克隆的人APT1啟動子序列具有較強的啟動子活性，preS2可激活APT1啟動子。這些研究結(jié)果不僅有助于深入研究APT1在細胞的諸多生理和病理過程中的作用，而且有助于闡明HBV感染導致的疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制。

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Hepatitis B virus preS2 activates human acyl protein thioesterase 1 promoter*

YangYi,LiuJianxiang,LiHongyan,HuangHaixia,ShiYunlong,LiuYongming△,SuHeling▲

(InstitutionofBiochemistryandMolecularBiology,GuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541100,China)

ObjectiveTo investigate the trans-regulative effect of hepatitis B virus (HBV) preS2 on the promoter of human acyl protein thioesterase 1 (APT1) gene.MethodsThe promoter sequence of human APT1 gene was identified applying the software of bioinformatics.The APT1 promoter and HBV preS2 gene were amplified with PCR and cloned into pGL3 and pcDNA3.1(-) plasmids to construct the luciferase reporter gene plasmid of human APT1 gene promoter pGL3-APT1 and the preS2 eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(-)-preS2,respectively.The effect of the preS2 on the human APT1 gene promoter was examined by cotransfecting hepatocellular carcinoma cell HepG2 with pGL3-APT1 and pcDNA3.1(-)-preS2 and measuring luciferase activities of the HepG2 cells.The statistical data were analyzed with independent-samplesttest.ResultsBoth plasmids of pGL3-APT1 and pcDNA3.1(-)-preS2 were confirmed by DNA sequencing to be accurately constructed as design.The luciferase activity of the pGL3-APT1 was 1.2 times (P<0.01) that of the positive control plasmid pGL3-Control.And the luciferase activity of the HepG2 cells cotransfected with pcDNA3.1(-)-preS2 and pGL3-APT1 was 2.6 times (P<0.01) that of the HepG2 cells cotransfected with the plasmid without preS2 gene pcDNA3.1(-) and pGL3-APT1.ConclusionThe human APT1 promoter cloned in the study has high promoter activity;HBV preS2 activates human APT1 promoter.

hepatitis B,rivus;viral proteins;protein precursors;acyl protein thioesterase 1;promoter;transactivation

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.012

國家自然科學基金資助項目(81460320)；廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019233)；廣西壯族自治區(qū)研究生教育創(chuàng)新計劃資助項目(YCSZ2014205)；廣西高等學校優(yōu)秀中青年骨干教師培養(yǎng)工程資助成果。

：楊易(1988-)，在讀碩士，主要從事分子病理學研究。△

，Tel:13737700363;E-mail:liuym@glmc.edu.cn；▲通訊作者,Tel:13978348621;E-mail:helingsu@glmc.edu.cn。

R373.2

A

1671-8348(2015)29-4063-03

2015-04-15

2015-05-16)