吳亞麗， 呂 芳， 郭立達(dá)*

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系 /廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 廣州510300；2.河北工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系，河北 石家莊050091）

姜黃素對大腸癌細(xì)胞Caspase-3和PARP表達(dá)的影響

吳亞麗1， 呂 芳2， 郭立達(dá)*2

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系 /廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 廣州510300；2.河北工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系，河北 石家莊050091）

為了探討姜黃素對LoVo細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（PARP）表達(dá)的影響，明確其治療大腸癌的生物學(xué)基礎(chǔ)。用不同濃度姜黃素處理體外培養(yǎng)的人大腸癌LoVo細(xì)胞，采用MTT法檢測姜黃素對LoVo細(xì)胞的增殖抑制作用，倒置顯微鏡觀察姜黃素對LoVo細(xì)胞集落形成的影響；Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞凋亡；采用分光光度法檢測Caspase-3酶活性；Western blotting檢測姜黃素作用前后Caspase-3和PARP蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果顯示姜黃素可抑制人大腸癌LoVo細(xì)胞的生長増殖，并能抑制細(xì)胞集落的形成，降低細(xì)胞增殖生存率，激活Caspase-3的表達(dá)，呈量效和時間依賴性，20 μmol/L以上濃度姜黃素能顯著誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡，上調(diào)Caspase-3和PARP蛋白表達(dá)。這表明姜黃素能顯著抑制LoVo細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，其分子機制與調(diào)節(jié)Caspase-3和PARP的表達(dá)相關(guān)。

姜黃素；Caspase-3；PARP；凋亡；大腸癌

大腸癌是消化道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，但目前對大腸癌的治療效果并不理想，為了預(yù)防癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，減輕患者痛苦，提高生存質(zhì)量，眾多的醫(yī)藥科研工作者將目光投向了植物來源的物質(zhì)，將普遍存在于食物中的植物源化合物用于癌癥的化學(xué)治療或化學(xué)預(yù)防[1-2]。

姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的一種天然植物多酚，為姜黃的主要活性成分，其藥理作用非常廣泛，在許多腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤和化學(xué)預(yù)防作用[3-4]。目前，姜黃素的體內(nèi)外抗癌研究已經(jīng)成為腫瘤化學(xué)預(yù)防及治療領(lǐng)域的熱點之一。因姜黃素的抗癌機制比較復(fù)雜，至今未完全闡明。作者擬探討姜黃素對大腸癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)，及對Caspase-3和PARP蛋白的調(diào)節(jié)，為進一步闡明姜黃素的抗腫瘤機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人大腸癌細(xì)胞株LoVo：廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科惠贈。姜黃素：購自Sigma公司；胎牛血清：購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）：購自北京索來寶科技有限公司；Caspase-3活性分光光度計檢測試劑盒：購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Caspase-3單抗購自abcam公司；PARP單抗：購自上海艾博思生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 LoVo細(xì)胞的培養(yǎng) 人大腸癌細(xì)胞株LoVo培養(yǎng)于含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合率達(dá)到85%左右時，用胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)[1]。

1.2.2 MTT比色法分析細(xì)胞活力 收集生長良好的LoVo細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后，更換為0、5、10、20、40、80 μmol/L梯度濃度的姜黃素培養(yǎng)液，實驗組（T，梯度姜黃素培養(yǎng)液）接種6個孔，陰性對照組（C，培養(yǎng)液中不含姜黃素）接種3個孔，空白對照組（B，等量PBS）接種3個孔，飽和濕度條件下繼續(xù)孵育培養(yǎng)24，48，72 h。待培養(yǎng)結(jié)束，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸棄孔內(nèi)上清，加入DMSO 150 μL/孔，靜置孵育30 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570 nm光吸收值，參照郭立達(dá)等的方法[1]，計算細(xì)胞存活率。

1.2.3 集落形成實驗 含0、5、10、20、40、80 μmol/ L梯度濃度姜黃素的RPMI1640培養(yǎng)液孵育LoVo細(xì)胞2 h后，計數(shù)細(xì)胞，按每孔200個接種到24孔培養(yǎng)板中，飽和濕度條件下培養(yǎng)6～9 d，PBS清洗2次，體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定10 min，顯微鏡下觀察計數(shù)，參照郭立達(dá)等的方法[1]，計算集落形成率和細(xì)胞相對增生存活率。

1.2.4 Hoechst 33258染色 用0～80 μmol/L梯度濃度姜黃素培養(yǎng)液孵育LoVo細(xì)胞48 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入5 mg/mL Hoechst 33258避光孵育20 min后，PBS洗滌1次，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記的細(xì)胞。

1.2.5 Caspase-3活性的測定 處于對數(shù)期生長的LoVo細(xì)胞，其一用含0、5、10、20、40、80 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)液孵育48 h；其二用20 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)液孵育0、3、6、12、24、48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，PBS洗滌2次，離心收集細(xì)胞，加入裂解液冰浴裂解15 min；收集上清，-80℃保存。同時，取少量樣品按照Caspase-3酶活性檢測試劑盒說明進行檢測。

1.2.6 免疫蛋白印跡 收集經(jīng)不同濃度姜黃素（0、5、10、20、40、80 μmol/L）處理48 h的 LoVo細(xì)胞，PBS清洗，RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解 30 min，12 000 r/min離心10 min，檢測蛋白濃度，進行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，常溫封閉1 h，與一抗（1∶5 000 Caspase-3、1∶5 000 PARP和1∶5 000 actin）4℃孵育過夜，TBST洗膜 3次 （每次10 min），二抗室溫孵育1 h，洗膜后，ECL避光反應(yīng)3～5 min，用化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)觀察并掃描圖像，利用FujifilmLas-4000分析軟件統(tǒng)計目標(biāo)條帶的光密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對LoVo細(xì)胞生長增殖的影響

MTT比色法結(jié)果顯示不同姜黃素對LoVo細(xì)胞的生長均具有一定的抑制作用，但在不同時段其抑制強度不盡相同。作用24 h后，與空白對照組相比，10 μmol/L姜黃素可明顯抑制LoVo細(xì)胞活力 （P＜0.01），48 h后，相對更低濃度的姜黃素即可顯著抑制LoVo細(xì)胞的生長；而72 h后，抑制作用比48 h更為明顯（P＜0.05），抑制率隨培養(yǎng)時間的延長呈增長趨勢，即細(xì)胞活力呈下降趨勢（P＜0.05）。在同一時段，隨姜黃素作用濃度的增加，各組細(xì)胞活力均逐漸下降（P＜0.05），呈明顯劑量依賴關(guān)系，結(jié)果見圖1。

2.2 姜黃素對LoVo細(xì)胞集落的影響

如圖2所示，姜黃素濃度越高，集落的形成率越低，呈劑量依賴效應(yīng)；相對于對照組，姜黃素處理組能顯著降低LoVo細(xì)胞的相對增生存活率 （P＜0.05），見圖2。

2.3 姜黃素對LoVo細(xì)胞核形態(tài)的影響

不同濃度姜黃素誘導(dǎo)48 h后LoVo細(xì)胞核形態(tài)的變化見圖3，空白對照組LoVo細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)圓潤、染色均勻，隨姜黃素處理濃度增大，出現(xiàn)了半月形細(xì)胞核，細(xì)胞核碎裂，并形成凋亡小體。

圖1 姜黃素對LoVo細(xì)胞生長增殖的抑制作用Fig.1 Effects of curcumin on the growth and proliferation of LoVo cells

圖2 姜黃素對LoVo細(xì)胞集落形成的影響Fig.2 Effects of curcumin on colon formation of LoVo cells

2.4 姜黃素對LoVo細(xì)胞Caspase-3酶活的影響

Caspase-3檢測結(jié)果顯示，其酶活性隨著姜黃素劑量的增加而增強，呈濃度依賴關(guān)系。與空白對照組相比，Caspase-3活性分別提高了1.4，2.4，3.3和3.5倍，在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異（P＜0.05），見圖4A。20 μmol/L姜黃素處理的LoVo細(xì)胞，直到作用持續(xù)維持12 h以上，Caspase-3的活性才依次增強，其中在12，24和48 h的酶活性為空白對照組的1.5，2.5和3.4倍（P＜0.05）；且Caspase-3水平增加呈現(xiàn)時間依賴性，見圖4（b）。

圖3 姜黃素作用48 h對LoVo細(xì)胞核形態(tài)的影響（×400倍）Fig.3 Effects of curcumin-treated LoVo cells for 48 h on morphological changes of cell nucleus（Amplification rate×400）

圖4 姜黃素對LoVo細(xì)胞Caspase-3活性的影響Fig.4 Effect of curcumin-treated LoVo cells on Caspase-3 activity

2.5 姜黃素對Caspase-3和PARP表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示10 μmol/L姜黃素處理組能顯著激活 Caspase-3的表達(dá) （P＜0.01），5 μmol/L的姜黃素激活PARP蛋白的表達(dá)（P＜0.05），見圖5。

圖5 姜黃素對LoVo細(xì)胞Caspase-3和PARP蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of curcumin-treated LoVo cells on Caspase-3 and PARP protein expression

3 結(jié)語

大腸癌是消化系統(tǒng)最常見的一種惡性腫瘤。降低其發(fā)病率，提高患者生存率最有效的方法就是使用食物來源的化學(xué)預(yù)防制劑以延緩癌變過程。姜黃素作為中藥姜黃的一種活性物質(zhì)，有著廣泛的抗腫瘤譜。自Kuttan等[5]研究發(fā)現(xiàn)了姜黃素的抗腫瘤作用后，許多報道證實了姜黃素的體內(nèi)外抗腫瘤潛能[6-8]。由于在不同腫瘤細(xì)胞中姜黃素發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)的效應(yīng)也大有不同[9]。目前，姜黃素誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞LoVo發(fā)生凋亡的機制尚不明確。

通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素對LoVo細(xì)胞的生長增殖有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)一定的劑量和效應(yīng)依賴關(guān)系。Hoechst 33258熒光染料對細(xì)胞進行染色，發(fā)現(xiàn)姜黃素能使LoVo細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變，染色質(zhì)致密濃染，并形成凋亡小體。

Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族一個重要的凋亡效應(yīng)子[10-14]。其被激活后可觸發(fā)caspases級聯(lián)反應(yīng)，引起凋亡發(fā)生。作者采用caspase-3檢測試劑盒和Western blotting技術(shù)來檢測Caspase-3的活性，實驗結(jié)果顯示姜黃素可顯著激活Caspase-3的表達(dá)，并呈現(xiàn)時間和濃度依賴性關(guān)系。PARP是真核細(xì)胞中的DNA修復(fù)酶，可識別結(jié)構(gòu)損傷的片段DNA。Caspase-3一旦被激活，即可誘導(dǎo)PARP發(fā)生斷裂，使細(xì)胞進入凋亡途徑。作者也發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理能夠誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞中Caspase-3的激活，進而導(dǎo)致其底物PARP的裂解。

綜上所述，姜黃素可明顯抑制LoVo細(xì)胞的生長增殖，使細(xì)胞核發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，通過上調(diào)Caspase-3和PARP蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞發(fā)生凋亡。

[1]郭立達(dá).姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑抗結(jié)腸癌作用及其相關(guān)機制研究[D].石家莊：河北師范大學(xué)，2012.

[2]郭立達(dá)，焦振霞，宋瑛，等.姜黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的作用及機制研究 [J].中國中藥雜志，2013，13（38）：2191-2195.

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Effects of Curcumin on Caspase-3 and PARP Expression of Colorectal Carcinoma Cells

WU Yali1， LV Fang2， GUO Lida*2
（1.Department of Food，Guangdong Industry Technical College/Centre of Guangdong Higher Education for Engineering and Technological Development of Speciality Condiments，Guangzhou 510300，China；2.Department of Environment and Chemical Engineering，Hebei College of Industry and Technology，Shijiazhuang 050091，China）

This study aimed to elucidate the biological basis for the treatment of colorectal cancer using curcumin，by investigating the effects of curcumin on apoptosis of LoVo and the expression of apoptosis-related protein Caspase-3 and poly ADP-ribose polymerase（PARP）.The human colorectal carcinomacellsLoVo wasconventionally cultured in vitro by curcumin with different concentrations.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assays were performed to examine the inhibitionof LoVo cell proliferation induced by curcumin.The effect of curcumin on LoVo cells colony formation was observed under an inverted microscope.The fluorescent dye Hoechst 33258 was used to detect the apoptotic cells.The enzyme activity of Caspase-3 was measured using a spectrophotometric method.The levels of Caspase-3 and PAPR expression before and after curcumin treatment were determined with Western blot analysis.The LoVo cells proliferation and the cell colony formation could be inhibited by curcumin.The cell proliferation and survival of LoVo were reduced and the expression of Caspase-3 was activated dependent on the treated concentration and duration.The apoptosis of LoVo cell was significantly induced and the expressions of Caspase-3 and PARP were increased by curcumin with a concentration above 20 μmol/L.The results suggested that curcumin could significantly inhibit LoVo cell proliferation and induce cell apoptosis.The molecular mechanism was associated with the regulation of Caspase-3 and PARP expression.

curcumin，Caspase-3，PARP，apoptosis，colorectal cancer

Q 255

A

1673—1689（2015）07—0751—05

2014-09-13

廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心建設(shè)項目（GCZX-B1103）；河北省科技廳支撐計劃項目（13272511）；河北省中醫(yī)藥管理局資助項目 （2013005）；河北工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院博士基金資助項目 （BZ1201）；廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級科研項目（KJ201322）。

吳亞麗（1981—），女，河北石家莊人，講師，主要從事生物技術(shù)、檢測技術(shù)研究。E-mail：ericascut@126.com

*通信作者：郭立達(dá)（1980—），女，河北石家莊人，理學(xué)博士，講師，主要從事生物技術(shù)、檢測技術(shù)研究。E-mail：lidaguo815@foxmail.com