酆 淵， 茆 勇， 游慶軍， 徐靜靜*

9順維A酸對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A2增殖及凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究

酆 淵1， 茆 勇2， 游慶軍2， 徐靜靜*2

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 附屬醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫214062）

研究9順維A酸（9-cis RA）抑制肺腺癌細(xì)胞A2增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用并初步探討其作用機(jī)制。體外培養(yǎng)A2細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，實(shí)驗(yàn)組加9-cis RA使其終濃度為1、5、10 μmol/L，對(duì)照組加入二甲亞砜使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，采用MTT法檢測(cè)各組A2細(xì)胞增殖情況；使用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析藥物作用后各組細(xì)胞的凋亡率；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測(cè)各組細(xì)胞bax、fas、bcl-2基因的變化。9順維A酸對(duì)人肺癌細(xì)胞株A2增殖均有明顯的抑制作用（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著增高（P＜0.05），且隨著濃度的升高抑制作用和凋亡率也隨之提高。實(shí)驗(yàn)組bax mRNA、fas mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組bcl-2 mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論9-cis RA具有明顯的抗肺腺癌細(xì)胞A2增殖的作用，其機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)bax、fas基因和下調(diào)bcl-2基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

9-順維A酸；肺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

維A酸廣泛存在于魚肝油、動(dòng)物肝臟、奶油、深色蔬菜以及橘色蔬菜水果之中。已證實(shí)維A酸類化合物能調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生命活動(dòng)[1-2]，最近的研究表明維甲酸類化合物通過(guò)與核維甲酸受體（RARs）及核維甲酸類X受體（RXRs）結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，在已知的維甲酸類化合物中，9-順維甲酸（9-cis RA）唯一能與這兩類核受體結(jié)合，因?yàn)槠渖飳W(xué)活性強(qiáng)于其他維甲酸類化合物而倍受矚目[3-4]。作者旨在觀察9-cis RA誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞株凋亡與bax、fas和bcl-2基因表達(dá)的關(guān)系，為9-cis RA臨床治療肺癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

9-cis RA，純度98%，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)液：購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；胎牛血清：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒：購(gòu)自美國(guó)Bio Basic公司；PCR MasterMix試劑：購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；凝膠電泳用瓊脂糖：購(gòu)自美國(guó)Bio Basic公司；PCR相關(guān)試劑及引物合成：購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；人肺腺癌細(xì)胞株A2：北京中日友好醫(yī)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

A2細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液RPMI含體積分?jǐn)?shù)10%滅活小牛血清及青、鏈霉素各100 U/mL，所有用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成1×105/mL細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞于 96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，加入9-cis RA，使實(shí)驗(yàn)組9-cis RA終濃度依次為1、5、10 μmol/l，陰性對(duì)照組不含9-cis RA。每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組分別培養(yǎng) 48 h后，按MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行操作。

以上4組細(xì)胞分別培養(yǎng) 48 h后，用不含EDTA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化，然后分別按以下兩步驟操作：①用PBS洗滌細(xì)胞兩次（2 000 r/min離心，5min）收集細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC混勻后，再加入5 μL的Propidium Iodide混勻，室溫、避光、反應(yīng)5～15 min后，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；② 按Trizol試劑說(shuō)明書提取總 RNA，引物序列使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并在NCBI上進(jìn)行BLAST對(duì)比，引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)各組bax、fas、bcl-2 mRNA表達(dá)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間分析采用單向方差分析 （One-Way-ANOVA）多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 9-cis RA對(duì)A2細(xì)胞增殖的抑制作用

9-cis RA對(duì)人肺癌細(xì)胞株A2增殖均有明顯的抑制作用（P＜0.01），且隨著濃度的提高抑制率也隨之提高，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 9-cis RA對(duì)A2細(xì)胞作用48h后，對(duì)A2細(xì)胞凋亡率的影響

不同濃度9-cis RA作用于肺癌細(xì)胞A2 48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。結(jié)果顯示：對(duì)照組凋亡率為（6.28±0.23）%；9-cis RA（1 μmol/l）組凋亡率為（10.07±0.53）%；9-cis RA（5 μmol/l）組凋亡率為（10.63±0.14）%；9-cis RA（10 μmol/l）組凋亡率為（15.45±0.41）%。經(jīng)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的單因素ANOVA統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果顯示：與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率相比，不同濃度9-cis RA組均有所增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但9-cis RA（1 μmol/l）組與9-cis RA（5 μmol/l）組凋亡率差異不明顯（P＞0.05）。

表1 各組光密度值和細(xì)胞抑制率比較Table 1 Comparison of optical density values and cell inhibition rates in each group

2.3 各組bax mRNA、fas mRNA、bcl-2 mRNA表達(dá)變化

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 bax mRNA、fas mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，bcl-2 mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。RTPCR檢測(cè)目的基因的變化結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

表2 各組作用A2細(xì)胞48 h后，目的基因和 β-actin mRNA灰度比Table 2 mRNA gray ratio of target genes to beta-actinin A2 cells after 48 h

表2 各組作用A2細(xì)胞48 h后，目的基因和 β-actin mRNA灰度比Table 2 mRNA gray ratio of target genes to beta-actinin A2 cells after 48 h

與對(duì)照組比較：*P＜0.05。

?

圖1 RT-PCR檢測(cè)各組bax基因mRNA表達(dá)Fig.1 Expression of bax mRNA by RT-PCR

圖2 RT-PCR檢測(cè)各組fas基因mRNA表達(dá)Fig.2 Expression of fas mRNA by RT-PCR

圖3 RT-PCR檢測(cè)各組bcl-2基因mRNA表達(dá)Fig.3 Expression of bcl-2 mRNA by RT-PCR

3 討論

已知細(xì)胞內(nèi)的維甲酸受體有兩種形式：即核維甲酸受體（RARs）和核維甲酸類X受體（RXRs），9-cis RA進(jìn)入細(xì)胞后可與這兩類受體結(jié)合。目前認(rèn)為，RARs-RXRs復(fù)合體是9-cis RA發(fā)揮作用的真正受體形式，9-cis RA與受體復(fù)合物結(jié)合后，激活DNA上特異的維甲酸識(shí)別元件，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄機(jī)制，抑制相關(guān)原癌基因和（或）誘導(dǎo)抑癌基因表達(dá)，發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)9-cis RA在低濃度時(shí)作用較弱，而在較高濃度（＞10-6mmol/L）對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖具有明顯抑制作用，并能誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的凋亡[5]。作者研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中凋亡發(fā)生率顯著高于對(duì)照組，而且10 μmol/L 9-cisRA抑制肺癌細(xì)胞A2增殖和誘導(dǎo)凋亡作用顯著高于1 μmol/L組和5 μmol/L組，也呈現(xiàn)濃度依賴性，與國(guó)外的相關(guān)研究成果一致。

研究證實(shí)9-cisRA誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能有：通過(guò)Rb基因表達(dá)增加和cyclinD1基因表達(dá)減少途徑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡；通過(guò)凋亡抑制基因bcl-2家族對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡實(shí)施調(diào)控。游慶軍[6-7]等人研究認(rèn)為9-cisRA可能引起抑癌基因Rb表達(dá)增加和原癌基因cyclinD1表達(dá)減少，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F，使癌細(xì)胞阻滯在G1期，阻止分化期中的細(xì)胞增殖，直接誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡或通過(guò)影響P53、cmyc、E1A等基因的表達(dá)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑。更多的研究顯示腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控可能與死亡受體信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Fas/FasL基因的異常表達(dá)有關(guān)。研究表明9-cisRA通過(guò)上調(diào)肺癌細(xì)胞中fas基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Fas/FasL信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)控，同時(shí)通過(guò)降低bcl-2 mRNA和提高bax mRNA表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Fas屬于腫瘤壞死因子受體（也稱死亡受體）家族，是細(xì)胞膜上的糖基化穿膜蛋白，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著傳遞細(xì)胞凋亡信號(hào)作用。細(xì)胞表面表達(dá)的Fas與FasL交聯(lián)后，形成能傳達(dá)信號(hào)的活性三聚體 （死亡結(jié)構(gòu)域DD），F(xiàn)as與死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADD）形成二聚體，將凋亡信號(hào)傳導(dǎo)至凋亡蛋白酶caspase-8，進(jìn)而引起一系列酶聯(lián)反應(yīng)，激發(fā)下游caspase-3、6、7，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。作者用RTPCR檢測(cè)的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組fas表達(dá)明顯高于對(duì)照組。Bcl-2屬膜蛋白，主要存在于線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞膜內(nèi)表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體膜、核膜等處。Bcl-2具有恢復(fù)線粒體內(nèi)膜的跨膜電位和關(guān)閉線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的作用，可使線粒體膜通透性降低，阻止凋亡啟動(dòng)因子釋放，切斷細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如抑制促進(jìn)凋亡的蛋白Bax的毒性作用、抑制caspase激活、維持細(xì)胞能鈣的穩(wěn)定等，具有很強(qiáng)的抗凋亡作用；Bax主要促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bcl-2過(guò)表達(dá)時(shí)，與Bax形成異二聚體抑制細(xì)胞凋亡；相反，Bax過(guò)表達(dá)時(shí)，Bax形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控不僅取決于自身表達(dá)水平高低，還與兩者的比例有關(guān)，當(dāng)Bcl-2/ Bax比例減少時(shí)，細(xì)胞趨于凋亡[9-10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組bcl-2表達(dá)明顯低于對(duì)照組、bax表達(dá)明顯高于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡增加。9順維甲酸誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A2凋亡可能與fas、bax表達(dá)增加，bcl-2表達(dá)減少有關(guān)，是通過(guò)死亡受體途徑及線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，9順維甲酸具有抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期、提高bax、fas基因的表達(dá)，降低bcl-2基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，為提高肺癌的治療效果提供一種新的途徑。

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Effects of 9-Cis-Retinoic Acid on the Proliferation and Apoptosis of Human Lung Cancer Cell Line A2

FENG Yuan1， MAO Yong2， YOU Qinjun2， XU Jingjing*2
(1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Affiliated Hospital，Jiangnan University，Wuxi 214062，China）

The study aimed to explore the mechanism of 9-cis-retinoic acid（9-cis RA）inhibiting proliferation and inducing apoptosis in human lung cancer cell line A2.Cultured A2 cells were randomly divided into four groups，the experimental group received 9-cis RA to a final concentration of 1，5 or 10 μmol/L，and the control group was added dimethyl sulfoxide to a final concentration of 0.1%.The MTT method was used for the determination of cell proliferation，flow cytometry（FCM）for the analysis of apoptosis，and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）for the expression changes of bax，fas and bcl-2 genes.Results showed that 9-cis RA significantly inhibited the cell proliferation（P＜0.01）and the incidences of apoptosis in the experimental groups weresignificantly higher（P＜0.05），which depended on the concentration of 9-cis RA.The mRNA expressions of bax and fas genes in the experimental groups were significantly higher（P＜0.01）whereas the bcl-2mRNA expressionwas significantly lower than the control group（P＜0.01）. Therefore，9-cis RA significantly inhibitsthe proliferation of human lung cancer cell line A2，which may be related to the increased expressions of bax and fas genes and the decreased expression of bcl-2 gene，and then induced apoptosis.

9-cis-retinoic acid，lung cancer，cell proliferation，apoptosis

R 734.2

A

1673—1689（2015）07—0779—05

2014-08-20

無(wú)錫市醫(yī)院管理中心重大項(xiàng)目（YGZX1210）。

*通信作者：徐靜靜（1983—），女，江蘇泰州人，助理研究員，主要從事抗腫瘤藥物機(jī)理研究。E-mail：wxsytsg@126.com