王 梓 ，張 浩，郝 迪，李 旭，袁 玲，王 蕾#(.天津市醫(yī)藥科學研究所心腦血管藥物研發(fā)中心，天津 30000;.天津中新藥業(yè)集團股份有限公司達仁堂制藥廠生產(chǎn)供應部，天津 300457)

參附強心丸是天津中新藥業(yè)集團股份有公司達仁堂制藥廠研制，該藥根據(jù)“己椒藶黃丸”和“參附湯”化裁而來，具有益氣助陽，強心利水的功效，臨床治療慢性心力衰竭引起的心悸、氣短、胸悶喘促、面肢浮腫等療效較好。本研究旨在運用藥理學試驗的方法，觀察參附強心丸對慢性腎衰大鼠的溫陽利水作用，揭示參附強心丸的益氣、助陽、利水的作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 動物

Wistar 大鼠，雄性，體質量260 ～280 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號:SCXK(京)2006-0009。

1.2 藥物

受試藥物:參附強心丸，由天津中新藥業(yè)集團股份有公司達仁堂制藥廠提供，棕色粉末，規(guī)格為1 g 生藥/g 藥粉，批準文號:zj001。陽性對照藥:地塞米松片，天津力生制藥股份有限公司，規(guī)格:0.75 mg/片，批準文號:1012029。造模藥物:腺嘌呤C5H5N5，購自上海潤捷化學試劑有限公司，純度≥98.0%，批號:101101。使用前用1.0%羧甲基纖維素鈉配制成2%腺嘌呤混懸液。

1.3 儀器

雙探頭放射免疫γ 計數(shù)器(SN-697);PL203 精密電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司制造);電子溫度計;日本AU-640 型奧林巴斯全自動生化分析儀;日本OLYMPUS B071型顯微攝影器材;IDA-2000 高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 造模方法

采用“單腎切除合并腺嘌呤灌胃法”制備大鼠慢性腎衰竭模型:選用雄性Wistar 大鼠，右腎切除術后1 周，以200 mg/(kg·d)腺嘌呤混懸液灌胃［1-3］，連續(xù)14 d。假手術對照組僅對大鼠皮膚和肌肉進行切開、縫合操作，不切除腎臟。術后1 周對大鼠灌胃1.0%羧甲基纖維素鈉鹽(sodium carboxymethyl cellulose，CMC)，連續(xù)應用14 d。

2.2 動物分組及給藥方法

術后1 周，將存活的大鼠根據(jù)體質量按隨機數(shù)字表法分為模型對照組、地塞米松對照組(0.2 mg/kg，相當于臨床人用計量的10 倍)、參附強心丸2.14、1.07、0.54 g 生藥/kg 劑量組(分別相當于臨床人用劑量的20、10、5 倍)，灌胃體積10 ml/kg，1 日1 次，共3 周。假手術組和模型對照組大鼠灌胃同體積純凈水。

2.3 觀察方法及指標

觀察大鼠體質量、皮毛、活動等一般生存情況。試驗結束時，對大鼠進行腹主動脈采血，全自動生化儀測定血清尿素氮(UREA)和肌酐(CREA)含量。對大鼠進行腹主動脈采血，放免法測定血中血管緊張素Ⅱ(AngII)和醛固酮(ALD)含量。試驗結束時，對大鼠進行腹主動脈采血，測定血清中鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)、鈣(Ca2+)、磷(P3+)含量。使用電子溫度計測定大鼠肛溫。取血結束后，將腎衰大鼠的左腎取出，稱取濕質量，計算腎體比，腎體比(g/100 g BW)=腎臟質量(g)/體質量(g)×100。將大鼠稱質量后的左腎，用刀片在矢狀面剖開以利于固定，置入12%甲醛中，制作石蠟切片，常規(guī)HE 染色，光學顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學改變。將腎組織損傷病變程度分級為5 級，用秩和檢驗進行統(tǒng)計學比較。

2.4 統(tǒng)計學方法

本研究中所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件多組間單因素方差分析進行統(tǒng)計，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般生存狀態(tài)比較

肉眼觀察模型對照組大鼠出現(xiàn)皮毛稀疏，蜷臥少動，消瘦等衰弱體征;參附強心丸3 個劑量組大鼠一般狀況較模型對照組明顯好轉，皮毛致密光亮。

3.2 各組大鼠腎功能及神經(jīng)內分泌激素指標比較

模型對照組大鼠的UREA、CREA 含量明顯升高;參附強心丸3 個劑量組和地塞米松對照組大鼠的UREA、CREA 水平均明顯低于模型對照組;模型對照組和參附強心受試組大鼠的AngⅡ顯著低于假手術對照組，ALD 明顯高于假手術對照組;參附強心丸2.14 g/kg 組和地塞米松對照組大鼠的ALD 較模型對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

3.3 各組大鼠不同電解質指標比較

模型對照組大鼠呈高鉀、低鈣、高磷血癥;參附強心丸2.14 g/kg 組大鼠可糾正低血鈣癥;參附強心丸3 個劑量組大鼠均能糾正高磷血癥;地塞米松對照組大鼠可糾正CRF 大鼠高鉀、低鈣、高磷血癥，使血鉀、血鈣、血磷接近正常水平，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

3.4 各組大鼠體溫、腎臟質量及腎體比情況比較

模型對照組大鼠體溫明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，由于腎衰竭使體溫調節(jié)功能異常導致體溫過低，基礎代謝率下降;參附強心丸各劑量組未見體溫回升的作用;地塞米松組體溫過低，可能與糖皮質激素對體溫調節(jié)中樞的抑制作用有關［4］。

表1 各組大鼠腎功能及神經(jīng)內分泌激素指標比較±s)Tab 1 Comparison of kidney function and neuroendocrine hormone indexes of rats in different groups(ˉx±s)

表1 各組大鼠腎功能及神經(jīng)內分泌激素指標比較±s)Tab 1 Comparison of kidney function and neuroendocrine hormone indexes of rats in different groups(ˉx±s)

注:與假手術對照組比較，△P ＜0.05，* P ＜0.001;與模型對照組比較，★P ＜0.05，#P ＜0.01，※P ＜0.001Note:vs.Sham operation control group，△P ＜0.05，* P ＜0.001;vs.model control★P ＜0.05，#P ＜0.01，※P ＜0.001

組別腎功能 神經(jīng)內分泌激素UREA/(mmol/L) CREA/(umol/L) AngⅡ/(pg/ml) ALD/(ng/ml)假手術對照組(n=10) 5.90±0.55 23.94±2.32 1 862.123±95.253 0.265±0.058模型對照組(n=10) 40.48±8.15* 199.92±52.31* 760.802±412.678* 0.551±0.188△參附強心丸2.14 g 生藥/kg(n=10) 27.99±7.77# 122.55±37.26# 610.990±399.512 0.342±0.122★參附強心丸1.07 g 生藥/kg(n=10) 27.87±6.14# 130.05±27.53# 405.727±271.834 0.357±0.125參附強心丸0.54 g 生藥/kg(n=10) 27.36±6.90# 138.90±51.62# 492.861±461.638 0.532±0.195地塞米松0.2 mg/kg(n=10) 24.24±5.42※ 79.14±16.74※ 938.768±642.430★ 0.227±0.082※

表2 各組大鼠不同電解質指標比較(ˉx±s)Tab 2 Comparison of various electrolyte indexes of rats in different groups(ˉx±s)

模型對照組大鼠腎臟質量明顯大于假手術對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);參附強心各劑量組大鼠腎臟質量較模型對照組均降低，其中2.14 g·kg-1組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);地塞米松對照組大鼠腎臟質量降低最明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，但由于該組大鼠體質量明顯降低，因此，其與模型對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);參附強心丸2.14 g·kg-1組大鼠不但腎臟質量明顯降低，該組大鼠體質量增長趨勢亦得以改善，因此，計算所得腎體比亦明顯低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表3。

表3 各組大鼠體溫、腎臟質量及腎體比情況比較(ˉx±s)Tab 3 Comparison of body temperature，ratio of the kidney weight versus kidney volume of rats in different groups(ˉx±s)

3.5 各組大鼠腎組織形態(tài)學情況比較

肉眼觀察可見，正常對照組大鼠腎臟大小、硬度、顏色均正常，表面光滑，腎包膜容易剝離，切面皮髓質分界清楚，皮質無增厚現(xiàn)象。模型對照組大鼠腎臟體積明顯增大，腎臟表面成灰白色顆粒狀，為典型“大白腎”表征，腎包膜與腎實質粘連不易剝離，切面皮髓質分界不清。參附強心各劑量組和地塞米松對照組大鼠腎臟體積明顯小于模型對照組，且蒼白程度較輕，見圖1。

圖1 肉眼所見模型組大鼠腎臟改變圖Fig 1 The naked eye can see model group rats kidney change figure

腎臟病理學檢查結果表明，假手術對照組大鼠腎組織結構無異常，被膜光滑，皮髓質結構清楚，腎小球體積未見縮小或肥大，數(shù)目未見減少，腎小管上皮細胞未見變性、壞死或脫落，管腔中未見管型及結石，腎間質未見炎細胞浸潤及纖維組織增生。模型對照組大鼠病變明顯，腎體積增大顯著，多數(shù)腎小管高度擴張，上皮細胞萎縮，腎小球數(shù)目減少，部分纖維化，間質可見大量炎細胞浸潤，部分腎組織充血、水腫及纖維組織增生，正常腎組織僅見小島狀分布或不見，見圖2。參附強心丸2.14、1.07、0.54 g/kg 劑量組與模型組大鼠相比，病變不同程度地明顯減輕，腎體積增大有所控制，擴張的腎小管減少，間質炎細胞浸潤、腎組織充血、水腫及纖維組織增生均呈不同程度減輕，正常腎組織所占比例增多，其中以2.14、1.07 g/kg 劑量組更為顯著，見圖3。地塞米松組與模型組大鼠比較，病變減輕最明顯，腎小管擴張、間質炎細胞浸潤、腎組織充血、水腫及纖維組織增生均明顯減輕，每視野能見到更多的正常腎組織，見圖4。

圖2 模型對照組腎組織病理圖(×100)Fig 2 Pathology of kidney tissue in mode group(×100)

圖3 2.14 g 生藥/kg 組腎組織病理圖(×100)Fig 3 Pathology of kidney tissue in dosage group with 2.14 g/kg Shenfuqiangxin pills in crude drug(×100)

4 討論

4.1 模型建立

圖4 地塞米松對照組腎組織病理圖(×100)Fig 4 Pathology of kidney tissue in dexamethasone group(×100)

中醫(yī)對慢性心力衰竭的病因病機概括為心腎陽虛為本，血瘀水停為標。在對參附強心丸進行藥理試驗設計時，在建立慢性心力衰竭的動物模型之外，亦建立相應的、能體現(xiàn)心陽虛、腎陽虛、乃至陽虛水泛的中醫(yī)病因模型，觀察其溫陽益氣、利水化飲的作用［5］。本試驗選用“單腎切除合并腺嘌呤灌胃法”制備CRF 模型，高濃度腺嘌呤通過黃嘌呤氧化作用變?yōu)闃O難溶于水的2.8-二羥基嘌呤，其沉積于腎小管進而阻塞腎小管，抑制氮質化合物的排泄，該方法造成大鼠與人類CRF 較類似的代謝異常，包括氮質血癥、胍類化合物的蓄積、氨基酸代謝異常、電解質代謝紊亂和內分泌異常，腎近曲小管、部分遠曲小管及腎小球受損，腎臟呈大白腎甚至腎固縮，最終引起腎功能衰竭［3-8］。大鼠經(jīng)單側腎切除術后，由于留存腎工作負荷增加，導致腎臟呈代償性生長［9］，可促進腺嘌呤導致腎衰竭的病理發(fā)展，縮短模型制備周期。本試驗觀察到大鼠應用200 mg/kg腺嘌呤灌胃，1 日1 次，連續(xù)14 d 后，大鼠呈日益消瘦，蜷縮拱背，精神萎頓，體毛脫落，血UREA、CREA 明顯升高等腎功能異常;血中K+、P3+水平明顯升高，血Ca2+明顯降低等電解質異常。同時腎臟質量和腎臟指數(shù)均明顯增加，腎臟表面滿布灰白色顆粒，光鏡下觀察，腎組織內大量二羥基腺嘌呤結晶沉積，光鏡下可見模型對照組病變明顯，腎小管高度擴張，上皮細胞萎縮，腎小球數(shù)目減少，部分纖維化。

4.2 參附強心作用機制

本試驗結果表明，參附強心丸對CRF 大鼠治療作用明顯，其作用機制為:(1)溫煦陽氣:參附強心丸干預治療組較模型對照組大鼠腎陽虛癥狀明顯改善，體態(tài)舒展、皮毛光亮順滑、自主活動正常，該組大鼠體征為溫煦滋養(yǎng)狀態(tài)，可表明參附強心具有益氣溫陽之功。(2)生化指標的改善:中醫(yī)腎陽虛在臨床檢驗指標的體現(xiàn)之一，即為CREA、UREA 的異常［10］。中藥對腎陽虛的治療作用，可量化地體現(xiàn)在對生化指標的改善方面，3 個劑量組大鼠的參附強心丸均可使CRF 異常升高的CREA、UREA 明顯下降，表明該藥對腎臟濾過功能的修復作用。(3)糾正水鈉潴留:“水鈉潴留”用中醫(yī)病機可描述為“水飲內停”“陽虛水泛”，臨床最明顯的體征為水腫，但動物試驗對水腫的觀察欠直觀。ALD 可反映機體水鈉潴留狀態(tài)［11］，是觀察藥物利水的客觀指標之一。參附強心丸2.14 g/kg 可明顯降低腎陽虛大鼠ALD 含量，充分說明其利水的確切功效。(4)糾正電解質紊亂:參附強心丸對高鉀、低鈣、高磷血癥有明顯糾正功效。鉀的平衡失調會導致嚴重并發(fā)癥，高血鉀癥可致嚴重的心律失常甚至心搏驟停，高血磷和低鈣血癥可引起繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進，引起骨質脫鈣、骨軟化、纖維性骨炎等腎性骨病，因此對高鉀、低鈣、高磷血癥的及時糾正具有重要意義。(5)對腎臟組織結構的改善:參附強心丸可使病變的腎臟組織結構得以修復，使擴張腎小管減少，炎性、充血、水腫、增生等病理變化均減輕。

4.3 AngⅡ指標的偏低

AngⅡ指標數(shù)據(jù)表明，本試驗中采取的“單側腎切除合并灌胃腺嘌呤”法制備的CRF 大鼠AngⅡ并未升高，反而明顯降低，其原因可能是由于只有一側殘留病腎，慢性腎衰造成大鼠機體鈉和水排出降低，鈉潴留又使血容量擴張。而同時腎內壓并不低于原有水平，因而腎素分泌不增加［12］。因此，在血容量增加的條件下，大鼠血漿內腎素值則相比之下低于正常，相應的由其轉換的AngⅡ的數(shù)值亦低于正常。這與臨床CRF 的AngⅡ不一致［13］。有文獻報道，腺嘌呤150 mg/kg 應用4 周后，大鼠血漿AngⅡ和腎素均降低，故“單腎切除合并腺嘌呤灌胃法”制備CRF 模型在RAAS 系統(tǒng)的相關機制研究中有一些不太合適［14］。因此，今后在進行CRF 研究時，需對動物模型做以下優(yōu)化:(1)選用化學藥物造模時，要充分考慮該類化學物質導致的生化指標變化特點。(2)對試驗動物選用適當?shù)暮喜⑹中g術式，如合并腎下腹主動脈缺血再灌術等［16］，爭取在較短時間內實現(xiàn)心腎功能的共損、互損，縮短研究周期，并相應增加心腎損傷程度，高度模擬臨床心腎綜合征的病變特點。

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