代 濤，李松濤，趙紅玲，王小青，王良友

河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000

谷胱甘肽是廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)，具有重要生理功能的天然活性肽。其在體內(nèi)以兩種形態(tài)存在，還原型谷胱甘肽(γ-GSH，2)和氧化型谷胱甘肽(GSSG，3)，還原型谷胱甘肽由L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸組成，氧化型谷胱甘肽是由兩分子2 的巰基(-SH)經(jīng)氧化脫氫得到，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。在機(jī)體中大量存在并起主要作用的是還原型谷胱甘肽，但兩者可在酶的作用下相互轉(zhuǎn)化，有報(bào)道3 對2清除自由基有協(xié)同作用［1］?，F(xiàn)都成為效果較好的藥物。因其較好的抗氧化，清除自由基作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健品、食品工業(yè)、化妝品等領(lǐng)域［2-4］。

藥理學(xué)研究表明，2 中的巰基(-SH)是發(fā)揮抗氧化等作用的活性位點(diǎn)，故將其結(jié)構(gòu)中的γ-谷氨酸替換為α-谷氨酸，得到2 的類似物α-GSH(1)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。動物實(shí)驗(yàn)表明，其也有較好的抗氧化，清除自由基作用。

目前對于2 的制備方法的研究，國內(nèi)外報(bào)道的主要有溶劑提取法、酶合成法、液相合成法、發(fā)酵法［5-9］。其中溶劑提取法生產(chǎn)工藝比較落后、生產(chǎn)規(guī)模小且產(chǎn)量低，產(chǎn)品質(zhì)量不高。酶合成法操作較復(fù)雜、且需要底物氨基酸和昂貴的ATP，成本高。液相合成法反應(yīng)步驟多、反應(yīng)時間長、操作復(fù)雜、需光學(xué)拆分且產(chǎn)品純度不高，環(huán)境污染嚴(yán)重。缺點(diǎn)都較明顯，使用較少，目前工業(yè)生產(chǎn)以發(fā)酵法為主，但因其所得的目標(biāo)產(chǎn)物含量不高、提取困難、成本造價高、產(chǎn)率不穩(wěn)定，生產(chǎn)周期長等原因，應(yīng)用也受到限制。而1 因其不是體內(nèi)天然產(chǎn)物，發(fā)酵法無法直接獲得，合成方法目前報(bào)道較少。本研究采用Fmoc 固相多肽合成法，用逐步縮合的方式合成高純度1、2，再將2 經(jīng)氧化得高純度的3，并研究了三者對四氯化碳(CCl4，4)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的治療效果。

圖1 三種谷胱甘肽化學(xué)結(jié)構(gòu)式和合8 成路線圖Fig.1 Structure and synthetic route of 1，2 and 3

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent Technologies 1200 型高相液相色譜(HPLC，美國Agilent 公司);Newstyle 型反相半制備HPLC(江蘇漢邦科技有限公司);Christ 冷凍干燥機(jī)(德國);TDL-40B 型大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);Heal Force Easy 20 純水機(jī)(香港力康公司);752 型UV 分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);Agilent Technologies 6310 Ion trap LC/MS(美國Agilent 公司)。

2-氯三苯甲基氯樹脂(2-CTC 樹脂，替代度1.3 mmol/g，天津南開合成科技有限公司);Fmoc 保護(hù)的氨基酸有 Fmoc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Cys (Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu-Ot-Bu-OH，F(xiàn)moc-Glu (Ot-Bu)-OH 全部購自成都誠諾新技術(shù)有限公司;縮合試劑1-羥基苯并三氮唑(HOBt)，N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)，N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)由蘇州天馬醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供;哌啶、甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、三氟乙酸(TFA)、苯甲硫醚、乙二硫醇(EDT)、苯甲醚、間甲酚(m-Cresol)、三異丙基硅烷(TIS)、碘(I2)、雙氧水(30%H2O2)、無水乙醇、冰乙酸、碳酸氫鈉，維生素C 均為分析純;乙腈(高效液相色譜純)，超純水，4(CCl4，含量99.5%，批號20120722)，1、2 對照品(日本TCI 公司，含量＞98.0%)，3 對照品(上海源聚生物科技有限公司，進(jìn)口分裝，含量99.0%)，注射用還原型谷胱甘肽(2，陽性對照藥，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.6 g)，ALT、AST 測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

雄性清潔級昆明小鼠［體重(20 ±2)g，北京華阜康生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證SCXK(京)2009-0004］。

1.2 還原型谷胱甘肽(1、2)的制備

1.2.1 Fmoc-Gly-CTC Resin 的制備

將3.846 g(5 mmol)2-CTC 樹脂兩份分別投入反應(yīng)柱a、b 中，DCM 溶脹0.5 h，抽干。DMF 洗滌(50 mL × 5，每次1 min)后，抽干。將4.460 g(15 mmol)Fmoc-Gly-OH、5.239 mL(30 mmol)DIPEA 兩份分別用50 mL DMF 在冰浴下溶解后投入兩反應(yīng)柱中，氮?dú)饩鶆虼捣鳎?0 ℃反應(yīng)1.5 h，DMF 洗滌(50 mL × 5，每次1 min)，除去過量反應(yīng)原料，制得Fmoc-Gly-CTC 樹脂。兩反應(yīng)柱中分別加入50 mL MeOH 封閉液(體積比為DCM∶MeOH∶DIPEA=80∶15∶5)封閉兩次，每次10 min，抽干，DMF 洗滌(50 mL × 5，每次1 min)，無水MeOH 洗滌(25 mL ×3，每次10 min)，減壓干燥至恒重，取少量所得樹脂進(jìn)行替代度檢測。由替代度測定方法［10］，測得Fmoc-Gly-CTC 樹脂替代度分別為0.94 mmol/g，0.93 mmol/g。

1.2.2 Glu(Ot-Bu)-Cys(Trt)-Gly-CTC 與Glu-Ot-Bu-Cys(Trt)-Gly-CTC 樹脂的制備

將5.400 g(5 mmol)制備好的Fmoc-Gly-CTC 樹脂兩份分別加入到反應(yīng)柱a、b 中，用DCM 溶脹0.5 h，抽干。加入30 mL 20%的哌啶/DMF 溶液，N2均勻吹拂反應(yīng)15 min，脫除Fmoc 基團(tuán)，用DMF 洗滌(50 mL × 3，每次1 min)，抽干，茚三酮檢測陽性。將8.786 g (15 mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、2.432 g(18 mmol)HOBt、2.787 mL(18 mmol)DIC 兩份分別用DMF 在冰浴下溶解，預(yù)反應(yīng)10 min 后，投入兩反應(yīng)柱中，N2吹拂，30 ℃反應(yīng)2 h 后取少量樹脂洗滌后滴加茚檢液，檢測陰性，反應(yīng)完全。DMF 洗滌(50 mL × 5，每次1 min)，除去多余的氨基酸等。再按照谷胱甘肽的氨基酸序列，用上述方法分別偶聯(lián)Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH 與Fmoc-Glu-Ot-Bu-OH。

1.2.3 Glu-Ot-Bu-Cys(Trt)-Gly-CTC 樹脂的裂解

分別將1.36 g 干燥至恒重的Glu(Ot-Bu)-Cys(Trt)-Gly-CTC 與Glu-Ot-Bu-Cys(Trt)-Gly-CTC 樹脂置于兩圓底燒瓶中，冰浴攪拌下分別加入13.6 mL經(jīng)冷凍的TFA-EDT-m-Cresol(體積比為95∶4∶1)裂解液，反應(yīng)0.5 h 后，逐漸升至室溫，于室溫下繼續(xù)反應(yīng)1.5 h。經(jīng)粗過濾后將母液傾入120 mL 無水冰乙醚中，析出白色沉淀，4000 rpm 離心5 min，棄去上清液，重復(fù)5 次，減壓真空干燥至恒重，得粗肽分別為266、289 mg。

1.2.4 1、2 粗品的HPLC 鑒定分析

1、2 粗品進(jìn)行HPLC 分析，色譜柱為Innoval C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相為0.1%TFA/H2O(A)，0.1% TFA/5% H2O/CH3CN(B)，B相1%～21%，梯度洗脫20 min，流速為0.8 mL/min，檢測波長為215 nm，樣品濃度為1 mg/mL，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.5 1、2 純品的制備

分別稱取干燥至恒重的1、2 粗品各200 mg 分別溶于5 mL 超純水中，用反相半制備HPLC 分離純化，半制備柱Hedera ODS-2 反相硅膠柱(250 mm ×10 mm，10 μm)。收集主峰純度達(dá)99%的組分。冷凍干燥，得1、2 純品130 mg、136 mg。

1.3 3 的制備

1.3.1 3 粗品的制備

1.3.1.1 空氣氧化法

將100 mg 2 純品溶于5 mL 超純水中，用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)pH 6，混勻，恒溫?fù)u動(30 ℃)，HPLC 監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)72 h 達(dá)終點(diǎn)，冰乙酸調(diào)pH 3 以終止反應(yīng)。

1.3.1.2 雙氧水氧化法

將100 mg 2 純品溶于1 mL 超純水中，用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)pH 6，加入0.2 mL、30%的過氧化氫溶液，混勻，恒溫?fù)u動(30 ℃)，HPLC 監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，30 min 達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，冰乙酸調(diào)pH 3 以終止反應(yīng)。

1.3.1.3 碘氧化法

將100 mg 2 純品溶于1 mL 超純水中，加入2.758 mL、20 mg/mL 碘的乙醇溶液，使得碘與2 的摩爾比為1∶1.5，混勻，恒溫?fù)u動(30 ℃)，HPLC 監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，10 min 達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，飽和維生素C水溶液除去過量的碘以終止反應(yīng)。

1.3.2 3 純品的制備

將1.3.1.3 所得溶液注入反相半制備HPLC中，半制備柱Hedera ODS-2 反相硅膠柱(250 mm ×10 mm，5 μm)。分段收集，合并主峰純度達(dá)98%的組分，減壓真空干燥，得3 91.8 mg。取少量干燥至恒重的3 進(jìn)行HPLC 分析，分析條件同1.2.4。

1.4 1、2 與3 純品的ESI-MS 分析

分別取1、2 與3 純品各1 mg 分別溶于1 mL 超純水中，加少許乙腈，進(jìn)樣5 μL，ESI-MS 分析。

離子阱質(zhì)譜儀離子源:ESI;電離模式:正/負(fù)離子模式;質(zhì)量掃描范圍:m/z 50～1500 amu;毛細(xì)管電壓:-130.2 V。

1.5 三種谷胱甘肽保肝活性研究

將112 只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為14 組，每組8只，分別作為正常對照組、4(0.1%)致肝損傷模型組，注射用2 對照組(20、40、80 mg/kg)，肝損傷+合成1 組(20、40、80 mg/kg)，肝損傷+合成2 組(20、40、80 mg/kg)，肝損傷+合成3 組(20、40、80 mg/kg)。用生理鹽水將購買的注射用2、合成化合物1(α-GSH)、合成化合物2(γ-GSH)、合成化合物3(GSSG)分別配得濃度為0.2%、0.4%、0.8%的溶液，4 配成0.1%的花生油稀溶液。正常組和4 肝損傷模型組以10 mL/kg 劑量連續(xù)7 d 腹腔注射生理鹽水，其余12 組則以腹腔注射給予等劑量的相應(yīng)藥物。第7 d 給藥后，除正常組外各組按20 mL/kg 劑量腹腔注射給予0.1% 4 溶液，動物禁食24 h 后摘眼球取血600～800 μL，現(xiàn)制備血清并測定ALT 和AST 活性［11，12］。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間的比較采用兩樣本均數(shù)的t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)產(chǎn)物1、2、3 的表征與圖譜

還原型谷胱甘肽1(α-GSH):白色固體，總收率60%，粗品保留時間5.254 min，純品保留時間5.252 min，ESI-MS m/z:306.5［M-H］-，見圖2、圖3、圖5。

還原型谷胱甘肽2(γ-GSH):白色固體，總收率64%，粗品保留時間5.443 min，純品保留時間5.394 min，ESI-MS m/z:307.3［M-H］+，見圖2、圖3、圖5。

氧化型谷胱甘肽3(GSSG):白色固體，總收率57%，純品保留時間7.964 min，ESI-MS m/z:611.7［M-H］-，見圖4、圖5。

圖2 1、2 粗品的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 1 and 2 before purification

圖3 1、2 純品的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of 1 and 2 after purification

圖4 3 純品HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of pureified 3

2.2 合成條件的優(yōu)化

本研究采用Fmoc 固相合成法合成1、2，在全保護(hù)肽合成過程中，選擇合適的樹脂，縮合劑及替代度對提高純度、得率十分重要。由于兩者肽鏈較短，故選用了適合短肽合成，且合成速率較快的2-CTC 樹脂?？s合試劑選用縮合能力較強(qiáng)，價格低廉的DIC/HOBt 體系。替代度選用較高的1.3 mmol/g，這樣不僅可以提高收率，降低成本，還可以避免因替代度過高導(dǎo)致的相鄰分子間的相互作用，影響產(chǎn)品的純度和后處理。

圖5 三種谷胱甘肽ESI-MS 分析圖譜Fig.5 ESI-MS spectra of 1，2 and 3

在兩者合成過程中另一個影響產(chǎn)品純度和收率的重要因素就是切割條件的選擇。

2.2.1 裂解試劑

固相合成中切割反應(yīng)是在各種酸條件下完成的，一般不同的樹脂需要不同的切割試劑，同一樹脂也因肽側(cè)鏈保護(hù)基的不同而需要不同的試劑配方，以減少副反應(yīng)，提高純度。稱取干燥至恒重的2 樹脂，室溫下以不同配比的裂解試劑反應(yīng)2 h，結(jié)果見表1。結(jié)合純度、收率與成本確定C 配方為較優(yōu)的裂解試劑，1 樹脂裂解效果與之類似。

2.2.2 裂解溫度

一般認(rèn)為，低溫可以抑制副反應(yīng)的發(fā)生，適度提高溫度可以加快反應(yīng)速度，但不可過高，否則會使多肽降解，副反應(yīng)增多，嚴(yán)重影響產(chǎn)品純度。本實(shí)驗(yàn)選用不同裂解溫度進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)先將樹脂在冰浴條件下裂解0.5 h 后，再緩慢升至室溫(30 ℃)，較直接于室溫下裂解效果好。

2.2.3 裂解時間

通常情況下，適度延長反應(yīng)時間有利于反應(yīng)完全，提高得率，但若時間過長在脫除樹脂和保護(hù)基時會發(fā)生許多副反應(yīng)，同時當(dāng)多肽長時間處于強(qiáng)酸性環(huán)境中時，也會影響到肽的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)裂解2 h 時，反應(yīng)基本完全，且純度和收率都較高。

此外，本實(shí)驗(yàn)還利用不同的氧化方法［13］，通過氧化巰基為二硫鍵得到3，氧化在各自較優(yōu)的條件下進(jìn)行，并對氧化效果進(jìn)行了比較，結(jié)果見表2。

表2 不同氧化法氧化效果的比較Table 2 Comparison of different oxidation effect

從表中可知，空氣氧化的純度雖然較高，但收率較差，同時反應(yīng)時間長，且底物濃度必須較低，否則副產(chǎn)物較多，較為繁瑣。故工業(yè)多采用雙氧水氧化法，本實(shí)驗(yàn)除采用此法以外，還嘗試了碘氧化法，由

2.3 目標(biāo)產(chǎn)物的保肝活性

由表3 知，合成1(α-GSH)、2(γ-GSH)和3(GSSG)與注射用2 在80、40 mg/kg 劑量下都可以顯著降低小鼠肝臟血清中ALT 和AST 水平，而低劑量(20 mg/kg)作用稍弱。

表3 連續(xù)給予合成化合物1、2、3 與注射用2 后對4 致急性肝損傷小鼠血清ALT 與AST 的影響(，n=8)Table 3 Effects of synthetic compounds 1，2，3 and 2 for injection on serum ALT and AST of 4-induced acute liver injury in mice (，n=8)

表3 連續(xù)給予合成化合物1、2、3 與注射用2 后對4 致急性肝損傷小鼠血清ALT 與AST 的影響(，n=8)Table 3 Effects of synthetic compounds 1，2，3 and 2 for injection on serum ALT and AST of 4-induced acute liver injury in mice (，n=8)

注:與肝損傷模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01。Note:compare with liver injury model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01.

3 結(jié)論

通過與注射用γ-GSH 比較，小鼠急性肝損傷試驗(yàn)結(jié)果表明，合成化合物1(α-GSH)、2(γ-GSH)和3(GSSG)的高、中劑量組都可以顯著降低小鼠肝臟ALT 和AST 水平，其治療效果與同等劑量的注射用γ-GSH 無顯著差異。初步說明可以考慮此方法用于谷胱甘肽的合成。

1 Jin CY (金春英)，Cui JL (崔京蘭)，Cui SY (崔勝云)，et al.Synergistic effect of oxidized glutathione to glutathione and scavenging free radicals.Chem Anal (分析化學(xué))，2009，37:1349-1353.

2 Raghunathan VK，Ellis EM，Justice NAT，et al.Involvement of reduced glutathione and glutathione reductase in the chronic toxicity of hexavalent chromium tomonocytes in vitro.Toxicology，2007，23:105-106.

3 Every D，Morrison SC，Simmons LD，et al.Distribution of glutathione in millstreams and relationships to chemical and baking properties of flour.Cereal Chem，2006，83:57-61.

4 Jiang J (江潔)，Shan LF (單立峰).Preparation and application of glutathione.Feed Ind (飼料工業(yè))，2007，28:15-17.

5 Liu GQ (劉國琴)，Chen J (陳潔)，Zhao L (趙雷)，et al.Discussion of optimization method and technological conditions for extracting glutathione from wheat germ.J Henan Univ Tech (河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2007，28:1-5.

6 Wu WT (吳梧桐)，Lao XZ (勞興珍)，Zheng X (鄭珩)，et al.By the method of enzyme engineering technology of biosynthesis of glutathione (通過酶工程法生物合成谷胱甘肽).CN200710020902.1，2007-10-17.

7 Camera E，Picardo M.Analytical methods to investigate glutathione and related compounds in biological and pathological processes.J Chromatogr B，2002，781:181-206.

8 Chen J (陳堅(jiān))，Wei GY (衛(wèi)功元)，Li Y (李寅)，et al.Glutathione production by microbial fermentation.J Food Sci Biotech (食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào))，2004，23:104-110.

9 Chen X (陳雪)，Zhao WJ (趙文杰)，F(xiàn)eng J (馮軍)，et al.Strain screening of glutathione producing strain.Chin J Pharm Ind (中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2007，38:481-483.

10 Han Y (韓月)，Yin ZF (尹志峰)，Zhao HL (趙紅玲)，et al.Solid phase synthesis of pramlintide.Chin J New Drug(中國新藥雜志)，2012，21:1046-1049.

11 Xu SY (徐淑云)，Bian RL (卞如濂)，Chen X (陳修)，et al.Methodology of pharmacological experiment (藥理實(shí)驗(yàn)方法).Beijing:People＇s Medical Publishing House，2001.1346.

12 Sun J(孫鍵)，Xu HJ(徐宏江)，Zhu YH(朱裕輝)，et al.Preparation and hepatoprotective activity of oxidized glutathione system.Chin J Pharm Ind (中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2013，44:265-268.

13 Wang LY (王良友)，Pan HP (潘和平)，Chen ZY (陳正英).The formation of several two disulfide bonds in peptide synthesis method is introduced.Organ Chem (有機(jī)化學(xué))，1998，18:576-580.