李 群，譚韻雅，魏 琴，汪 超，游 玲

1四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101;2宜賓學(xué)院香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點實驗室，宜賓 644000

植物體內(nèi)各種次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生或增加主要通過各種生物或非生物因子誘導(dǎo)子調(diào)節(jié)代謝途徑、中間產(chǎn)物及關(guān)鍵酶活性等方式實現(xiàn)［1］。這些生物因子可能是植物激素物質(zhì)［2］，也可能是目標(biāo)代謝產(chǎn)物前體物質(zhì)［3，4］。將前體物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑的前提是明確該目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成途徑。雖然明確生物合成途徑的次生代謝產(chǎn)物并不多，但前提物質(zhì)一定是以中間代謝產(chǎn)物的形式存在于產(chǎn)生這些代謝產(chǎn)物的植物體內(nèi)，甚至于有相近化學(xué)成分的近緣植物體內(nèi)。目前在植物次生代謝產(chǎn)物積累方面，研究較多的是生物誘導(dǎo)子中的真菌誘導(dǎo)子［5-7］。而利用植物體本身或近緣種提取液作為誘導(dǎo)子的研究不多。王平等［8］研究表明，天竺桂水提液可促進油樟葉懸浮細(xì)胞黃酮類物質(zhì)積累。天竺桂與油樟為同屬植物，這可能與天竺桂水提液中存在黃酮類物質(zhì)誘導(dǎo)因子有關(guān)。

油樟(Cinnamomum longepaniculatum N.Chao ex H.W.Li.)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木，為重要的經(jīng)濟作物，其根、莖、葉、種子均可提芳香油。油樟葉中提取的芳香油主要成分為萜類物質(zhì)，占芳香油85%以上［8］，其中已報道有重要經(jīng)濟價值的成分有1，8-桉葉油素、r-松油烯、a-松油醇等［9-14］。油樟是中國特有天然香料。油樟主要分布于四川宜賓，目前資源不足30 萬畝，所產(chǎn)油樟油遠(yuǎn)不能滿足市場需求。探討油樟油及其組分產(chǎn)生的影響因子及相關(guān)基礎(chǔ)研究，有利于進一步充分利用油樟資源。本課題組前期分析檢測了油樟、大葉樟、香樟和天竺桂4 種樟屬植物葉水浸提液揮發(fā)性物質(zhì)組成成分情況，這些成分有共有性和物種特征性［15］。油樟油主成分1，8-桉葉油素的分子結(jié)構(gòu)中含有氧雜二環(huán)，推測其前提物質(zhì)可能為水溶性的。天竺桂等其它近緣種是否對油樟揮發(fā)性物質(zhì)的積累產(chǎn)生促進作用，這方面的研究未見報道。以此為出發(fā)點，本實驗將4 種樟屬植物油樟(Cinnamomum longepaniculatum N.Chao ex H.W.Li.)、大葉樟(Cinnamomum parthenoxylum)、香樟(Cinnamomum camphora)、天竺桂(Cinnamomum japonicum Sieb.)葉水浸提液添加到油樟懸浮培養(yǎng)系中，研究其水浸提液對油樟懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長及揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的影響，旨在初步探究油樟近緣種中是否存在有利于油樟揮發(fā)性物質(zhì)積累的物質(zhì)，為進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

油樟(Cinnamomum longepaniculatum N.Chao ex H.W.Li.)、大葉樟(Cinnamomum parthenoxylum)、香樟(Cinnamomum camphora)、天竺桂(Cinnamomum japonicum Sieb.)的葉片采自宜賓學(xué)院校園內(nèi)，由宜賓學(xué)院魏琴教授鑒定;1，8-桉葉油素(0.5 mL/支，HPLC≥99%)、α-松油醇(0.1 g/支，98%)和γ-松油烯(1 g/支，GC95%)三種標(biāo)品在北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司購回。

1.2 儀器

氣相色譜儀［Agilent7890A、氫火焰離子化檢測器(FID)］。

1.3 實驗方法

1.3.1 油樟懸浮細(xì)胞系的建立

參照魏琴等［16］的配方進行愈傷組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方是B5 +0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH5.8。將愈傷組織(約2 g鮮重)轉(zhuǎn)移到含40 mL 液體的培養(yǎng)基100 mL 錐形瓶中懸浮培養(yǎng)，每20 d 繼代一次，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min，25 ℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃。每三周繼代一次，連續(xù)繼代三次，直至愈傷組織較為疏松后用于建立懸浮培養(yǎng)體系。

1.3.2 樟屬植物葉水浸提液制備

采摘新鮮的油樟、大葉樟、香樟和天竺桂葉片洗凈，晾干，稱取40 g 放入打漿機中加入適量蒸餾水打2 min，用四層紗布過濾，濾液定容至1 L 就獲得濃度為40 g/L 的水提液。121 ℃高壓滅菌20 min后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 1，8-桉葉油素、γ-松油烯和α-松油醇3 種物質(zhì)混和標(biāo)樣的制備與檢測

稱取0.5 g 1，8-桉葉油素、γ-松油烯和α-松油醇標(biāo)品，分別置于50 mL 容量瓶中用乙醇定容，制成10 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取配好的10 g/L 的3 種標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋配制成濃度為0.1mg/L 的混和標(biāo)樣。取10 mL 培養(yǎng)物頂空進樣，進行氣相色譜檢測。

1.3.4 樟屬植物葉浸提液對懸浮細(xì)胞生長和揮發(fā)性物質(zhì)積累的影響

在懸浮培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.1%(100 mL 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基中添加0.1 mL 樟屬植物葉浸提液，以下同)、0.25%、1%、4%、10%的4 種樟屬植物葉浸提液，搖床轉(zhuǎn)速110 rpm，25 ℃條件下培養(yǎng)，以未加浸提液的實驗組作為對照，每組重復(fù)3 瓶，培養(yǎng)20 d。取10 mL 培養(yǎng)物(細(xì)胞加培養(yǎng)液)頂空進樣，進行氣相色譜檢測，以1，8-桉葉油素、a-松油醇和r-松油烯三種標(biāo)品制作混標(biāo)，用與樣品相同的方法進樣，用以對樣品中產(chǎn)物進行定性檢測。每組重復(fù)3次。

1.3.4.1 生物量的測定

將懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物抽濾，取細(xì)胞，置于烘箱中45 ℃干燥至恒重，稱其質(zhì)量為細(xì)胞干重。每組重復(fù)3 次。

1.3.4.2 GC-FID 條件

HP-5(30 m×320 μm ×0.25 μm)毛細(xì)管柱，平衡溫度95 ℃，平衡時間20 min。載氣為氮氣，氫氣流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min，氮氣尾吹氣25 mL/min，頂空進樣，分流比3.0。柱箱程序:90 ℃保持4 min，然后20 ℃/min 到130 ℃保持5 min，然后20 ℃/min 到190 ℃保持1 min，然后20 ℃/min到240 ℃保持1 min。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

以峰面積表示各物質(zhì)的產(chǎn)量，其中總揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物以總峰面積表示。試驗所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤即()表示。

1.3.6 方法學(xué)考察

1.3.6.1 精密度和穩(wěn)定性試驗

取1.3.3 中配制好的0.1 mg/L 的混標(biāo)，取10 mL 于頂空進樣瓶中，按1.3.4.2 方法重復(fù)進樣5次，計算1，8-桉葉油素、r-松油烯、a-松油醇及總峰面積的峰面積RSD(%)分別為1.92、1.04、1.20、1.66;取同一供試品在同一天內(nèi)重復(fù)進樣5 次，并連續(xù)進樣3 d，計算1，8-桉葉油素、r-松油烯、a-松油醇及總峰面積的峰面積日內(nèi)與日間RSD(%)分別為1.83、1.78、1.90、1.36。

1.3.6.2 回收率試驗

取1.3.3 中配制好的10 g/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水為溶劑配制成1、0.5、0.1 mg/L 的混標(biāo)，分別取5 mL 于頂空進樣瓶中，再分別加入5 mL 已測樣品，依1.3.4.2 中方法測定，計算出1，8-桉葉油素、r-松油烯、a-松油醇及總峰面積的峰面積回收率分別為100.11%、99.36%、100.04%、100.10%、99.45%，RSD(%)分別為1.55、1.89、1.28、1.88。

以上方法學(xué)驗證結(jié)果表明本實驗所用方法可靠。

2 實驗結(jié)果

2.1 混合標(biāo)樣GC-FID 分析

由混合標(biāo)品的氣相色譜檢測結(jié)果可知(圖1A)，1，8-桉葉油素、a-松油醇和γ-松油烯的出峰時間分別為2.840、3.167 和5.325 min。樣品中(圖1B)相同的出峰時間被認(rèn)為是與標(biāo)品相同的物質(zhì)。

圖1 混合標(biāo)樣(A)和樣品(B)GC-FID 總離子流圖Fig.1 GC-FID chromatograms of mix standard (A)and sample (B)

2.2 4 種樟屬植物葉水浸提液對懸浮細(xì)胞生長的影響

樟屬植物葉浸提液對懸浮細(xì)胞生長的影響見圖2。經(jīng)方差分析得知4 種樟屬植物葉水浸提液試驗組中的細(xì)胞干重與對照組相比均無顯著性差異，說明4 種水提液誘導(dǎo)子對油樟細(xì)胞生長既無明顯地促進作用也無明顯地抑制作用。

圖2 樟屬植物提取物處理后懸浮細(xì)胞的生物量(g/L)Fig.2 The biomass of suspension cell after processed by Cinnamomum plant extracts (g/L)

2.3 4 種樟屬植物葉水浸提液對次生代謝產(chǎn)物積累總量的影響

4 種樟屬植物葉水浸提液對次生代謝產(chǎn)物積累總量的影響見圖3。經(jīng)方差分析得知，絕大部分試驗組和對照組相比差異顯著。天竺桂與香樟水提液誘導(dǎo)子對次生代謝產(chǎn)物積累總量均呈低濃度促進高濃度抑制的作用效果，水浸提液添加量分別為4%和1%時促進作用最強，其總峰面積分別為空白對照組的1.78 和1.45 倍。大葉樟和油樟水提液對次生代謝產(chǎn)物積累總量均呈抑制作用，且隨著濃度的增加其抑制作用越強。

圖3 樟屬植物提取物處理后懸浮細(xì)胞中總揮發(fā)性物質(zhì)積累量(總峰面積/pA)Fig.3 The accumulation of total volatile substances in suspension cell after processed by Cinnamomum plant extracts (total peak area/pA)

2.4 4 種樟屬植物葉水浸提液對3 種萜類物質(zhì)積累的影響

4 種樟屬植物葉水浸提液對懸浮細(xì)胞3 種萜類物質(zhì)積累的影響見圖4。不同樟屬植物葉水浸提液對3 種萜類物質(zhì)積累的影響不同。

對于1，8-桉葉油素的積累，僅天竺桂水提液誘導(dǎo)子試驗組對1，8-桉葉油素積累呈低濃度促進高濃度抑制的影響，且在添加量為1%時促進作用最強，1，8-桉葉油素峰面積為空白對照組的1.46 倍，其余幾種誘導(dǎo)子在所設(shè)試驗濃度范圍內(nèi)對其均呈抑制作用，且濃度越高其抑制作用越強。

對于γ-松油烯的積累，4 種水提液誘導(dǎo)子在所設(shè)試驗濃度范圍內(nèi)對松油烯積累均呈促進作用，其中大葉樟、天竺桂和香樟水提液均在添加量為1%時促進作用最強，此時γ-松油烯峰面積分別為0.39、0.27 和0.32 pA，油樟水提液在添加量為4%時促進作用最強，此時γ-松油烯峰面積為0.27 pA。

對于α-松油醇的積累，天竺桂和香樟葉水浸提液對α-松油醇積累呈低濃度促進高濃度抑制的影響，且均是在濃度為0.25%時促進作用最強，此時α-松油醇峰面積分別為空白對照組1.62 和1.24倍，而大葉樟水提液對α-松油醇積累均呈抑制作用，且濃度越高其抑制作用就越強。

圖4 樟屬植物提取物處理后懸浮細(xì)胞中3 種萜類化合物積累量(峰面積/pA)Fig.4 The accumulation of 3 terpenoids in suspension cell after processed by Cinnamomum plant extracts (Peak area/pA)

3 討論

4 種樟屬植物葉水浸提液添加至懸浮細(xì)胞系后，細(xì)胞生長量未受太大的影響(圖2)，該措施保證了懸浮細(xì)胞的生物量。對于以收集次生代謝產(chǎn)物為目的的研究或生產(chǎn)有積極意義。

不同樟屬植物葉水浸提液添加至懸浮細(xì)胞系后，對揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物積累總量及3 種組分影響均不同(圖3、圖4)。這與這幾種植物葉水浸提液成分差異有密切關(guān)系［15］。本研究因為受標(biāo)品限制，僅檢測了目前開發(fā)利用價值較高、有標(biāo)品的3 種萜類物質(zhì)。4 種葉水浸提液對γ-松油烯均有促進作用，且是從無到有的誘導(dǎo)(對照中無)，這是否與4種葉水浸提液均含有2，2＇-亞甲基雙［6-(1，1-雙甲基乙基)-4-甲基］苯酚這個特征性化合物有關(guān)，有待進一步研究;對于1，8-桉葉油素的積累，僅天竺桂水提液有積極的誘導(dǎo)促進作用，這是否與天竺桂葉水浸提液中獨特而含量較高(91.82%)的順式-四氫化-2，5-二甲基-呋喃有關(guān)，有待進一步研究;天竺桂和香樟能促進α-松油醇的積累，這是否與二者的葉水浸提液中共同含有的1，2-苯二羧酸丁基(2-甲基丙基)酯、1，2-苯二羧酸單(2-乙基己基)酯、1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1，4-環(huán)已二烯、2，2＇-亞甲基雙［6-(1，1-雙甲基乙基)-4-甲基］苯酚及三乙酸甘油酯有關(guān)，有待進一步研究。這些代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)也可能是多種成分共同作用的結(jié)果。

由于本實驗中所加葉水浸提液含有與所測產(chǎn)物相同的物質(zhì)，在表示產(chǎn)物的積累時減去了誘導(dǎo)子中原本含有的含量，因此部分產(chǎn)物積累量為負(fù)值(圖3、圖4)。從本實驗的結(jié)果中可以看出，在高濃度條件下，其次生代謝產(chǎn)物峰面積降低或大多均為負(fù)值，這說明在高濃度葉水浸提液作用下，油樟細(xì)胞可能會消耗誘導(dǎo)子中的某些物質(zhì)，也許被當(dāng)做碳源用于細(xì)胞的生長，也許被轉(zhuǎn)化為其它的不具有揮發(fā)性或者揮發(fā)性差的物質(zhì)，也可能因為葉浸提液中目標(biāo)代謝產(chǎn)物的存在，反饋抑制導(dǎo)致含量下降。

在本研究中，所有對次生代謝產(chǎn)物有促進作用的試驗組，其誘導(dǎo)促進強度均不高，未超過對照的2倍(圖3、圖4)，這可能跟采葉的季節(jié)、時間有關(guān)，也與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件有關(guān)，有待進一步篩選條件。朱娜等［17］提到誘導(dǎo)子具有專一性、快速性、濃度效應(yīng)、時間效應(yīng)以及協(xié)同效應(yīng)。本研究僅討論了濃度效應(yīng)，專一性、時間效應(yīng)及協(xié)同效應(yīng)有待進一步研究。

本研究首次報道了以上幾種樟屬植物提取物誘導(dǎo)子對油樟懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中揮發(fā)性產(chǎn)物積累的作用，為利用油樟細(xì)胞生產(chǎn)一些有用次生代謝產(chǎn)物提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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