呂 玲，劉 漫，李和生

寧波大學(xué)海洋學(xué)院食品資源利用研究室，寧波 315211

鉛是自然界廣泛存在的重金屬元素。鉛不僅污染環(huán)境，還對我們的身體造成嚴(yán)重危害。鉛易通過消化道和呼吸道進(jìn)入人體，其半衰期長，能蓄積在體內(nèi)［1］并對人體各個系統(tǒng)均有毒害作用，其中主要病變在神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)。鉛中毒的早期癥狀主要是頭痛、無法集中注意力、反應(yīng)遲鈍等，中期通常導(dǎo)致貧血和肌肉癱瘓等病癥，嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致死亡現(xiàn)象。尤其是對兒童，如果兒童血液中鉛的含量超過0.6 μg/mL 時，就會出現(xiàn)智能發(fā)育障礙以及行為異常［2］。

黑色素是一種重要的生物資源，是由絡(luò)氨酸氧化而來的不規(guī)則多聚物，因結(jié)構(gòu)中存在可與金屬鍵結(jié)合的基團(tuán)(如-COOH、-NH2、-OH)，從而有吸附重金屬離子的特性［3］。目前有一些利用黑色素清除體內(nèi)重金屬的報道［4，5］。而烏賊作為一種豐富的海洋生物資源，如何將其充分利用是當(dāng)今的一個熱點(diǎn)問題。烏賊墨是烏賊加工中的廢棄物，它具有許多生物活性，如抗腫瘤活性［6-8］、抗氧化活性［9，10］、抗菌活性［11，12］、免疫活性［13］等。烏賊墨中主要的化學(xué)成分是黑素色，劉漫等［14］的研究表明烏賊墨黑色素對重金屬離子Pb2+有吸附作用。本課題以小鼠為研究對象，建立鉛中毒小鼠模型，觀察和分析烏賊墨黑色素對小鼠體內(nèi)Pb2+的脫除作用，為烏賊墨黑色素作為一種毒性陽離子脫毒劑的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)，同時為提高海洋生物資源的綜合利用率開拓一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗材料:金烏賊購于寧波市路林市場，-20 ℃冷凍儲藏。實(shí)驗動物:ICR 小鼠(24～28 g)，清潔級，由浙江省動物中心提供，合格證號:0008604。主要試劑:醋酸鉛，上?；瘜W(xué)試劑總廠;濃硝酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;高氯酸，天津市鑫源化工有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

FD-1D-80 冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司;H-1650 高速臺式離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)設(shè)備有限公司;AB 104-N 型分析天平，METTLER TOEDO 公司;2100DV 型電感耦合等電子體發(fā)射光譜ICP-AES，Perkin Elmer;TENSOR 27 紅外光譜儀，德國Bruker 公司;PB-10 pH 計，德國Sartorius 公司;LDZX-40KB 立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;CS101-1AB 電熱鼓風(fēng)干燥箱，重慶銀河試驗儀器有限公司;KDN-04 消化爐，上海新嘉電子有限公司;移液槍，德國Eppendorf 公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 烏賊墨黑色素的提取［15］

將冷凍的金烏賊墨囊在4 ℃下解凍，小心去皮去膜，擠出烏賊墨汁并收集于燒杯中。收集完成后加適量超純水浸泡過夜，然后10000 rpm 離心10 min，棄去上清液，沉淀部分繼續(xù)加水浸泡，然后再次離心，反復(fù)4 次。所得的沉淀用超純水沖洗，然后冷凍干燥，即得烏賊墨黑色素。

1.3.2 烏賊墨黑色素的紅外光譜

稱取100 mg 溴化鉀和1 mg 干燥的烏賊墨黑色素樣品于瑪瑙缽中攪拌混勻，在紅外燈照射下研磨成細(xì)粉，用壓片機(jī)壓制成片。使用TENSOR 27 紅外光譜儀，掃描500～3500 cm-1波長范圍的光譜吸收值。

1.3.3 動物分組及實(shí)驗

1.3.3.1 烏賊墨黑色素毒性實(shí)驗

ICR 小白鼠(雄鼠)，體重25 g 左右，隨機(jī)分為正常組和烏賊墨處理組，每組10 只。正常組小白鼠用3%苦味酸做標(biāo)記(1～10 號)，分兩籠飼養(yǎng):1～5號，6～10 號。烏賊墨處理組同正常組一樣標(biāo)記分籠飼養(yǎng)。正常組灌胃0.2 mL 超純水，烏賊墨處理組灌胃烏賊墨黑色素(4 g/25 mL，0.2 mL)，每日一次。所有小白鼠每日自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用去離子水。正常組和烏賊墨處理組中的1～5 號灌胃6 d后停止灌胃，24 h 后稱重并將其處死，采集肝臟和腦進(jìn)行稱重。剩下的小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)到12 d 后停止灌胃，24 h 后稱重并將其處死，采集肝臟和腦進(jìn)行稱重。

1.3.3.2 烏賊墨黑色素對鉛中毒小鼠的解毒實(shí)驗

ICR 小白鼠(雄鼠)，體重25 g 左右，隨機(jī)分為3組(每組10 只):正常組、鉛模型組、烏賊墨黑色素治療組。三組小鼠均用苦味酸標(biāo)記(1～10 號)，每組分兩籠飼養(yǎng)(1～5 號和6～10 號)。所有小白鼠每日自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用去離子水。鉛模型組與烏賊墨黑色素治療組腹腔注射醋酸鉛溶液(40 mg/kg)，正常組注射等量生理鹽水。烏賊墨黑色素治療組1～5 號于染鉛30 min 后灌胃烏賊墨黑色素(4 g/25 mL，0.2 mL)1 次，其余組的1～5 號灌胃等量超純水，24 h 后將每組的1～5 號處死，采集血液、腦和肝保存待測。烏賊墨黑色素治療組的6～10 號則于染鉛24 h 后灌胃烏賊墨黑色素(4 g/25 mL，0.2 mL)1 次，其余組6～10 號灌胃超純水，24 h 后處死各組剩下的小鼠，采集血液、腦以及肝保存待測。

1.3.4 測定指標(biāo)

1.3.4.1 黑色素對小鼠行為、體質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響

解剖時觀察肝臟病變，稱量各組織及體重，計算臟器系數(shù)。計算公式如下:

1.3.4.2 小鼠血液、腦、肝中鉛含量的測定

小鼠血液、腦和肝臟用硝酸-高氯酸混合液濕式消化。精確取一定體積(或重量)的待測樣于消化瓶中，按濃硝酸與高氯酸9∶1 的比例加入濃酸，放置過夜，次日將消化瓶置于消化爐上，先進(jìn)行低溫消解，以免瓶內(nèi)泡沫過多，當(dāng)泡沫減少時，則高溫煮沸至溶液呈現(xiàn)棕色，此時加少量硝酸再煮沸到冒白煙，至瓶內(nèi)溶液呈澄清的無色或淡黃色。將消化液冷卻至室溫，再轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，以去離子水洗消化瓶數(shù)次，合并消化液，加水定容。采用ICP-AES測定消化液中的鉛含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 烏賊墨黑色素紅外光譜

圖1 烏賊墨黑色素的紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of melanin from sepia

用紅外光譜表征烏賊墨的黑色素的功能基團(tuán)。由圖1 可以看出，烏賊墨黑色素的吸收峰主要是以下三組:3500～3300cm-1、1675～1500 cm-1和1000～1250 cm-1。其中3422.59 cm-1的強(qiáng)吸收峰為O-H 和N-H 伸縮振動;1632.60 cm-1吸收是羧酸基團(tuán)COO-的振動或芳環(huán)C=C 振動或酰胺中C=O 振動;1087.52 cm-1吸收是C-O 伸縮振動。烏賊墨黑色素主要是真黑色素。真黑色素以5，6-二羥基吲哚和5，6-二羥基吲哚酸為前體。吸收峰在3400 cm-1附近表示是C-N 延伸，屬于吲哚或吡咯環(huán)，吸收峰在1630 cm-1附近表示歸屬真黑素的吲哚環(huán)［16，17］。由圖1 可以判斷烏賊墨黑色素具有吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)，與李興旺從魷魚墨中精制黑色素的紅外圖譜基本一致［18］。

2.2 烏賊墨黑色素對小鼠臟器系數(shù)的影響

從表1 可知灌胃6 d 后正常組小鼠的肝臟和腦的臟器系數(shù)與烏賊墨處理組基本一致，由統(tǒng)計學(xué)分析得出這兩組臟器系數(shù)無顯著差異(P ＞0.05)。處理12 d 后正常組小鼠與烏賊墨處理組的臟器系數(shù)也不具有統(tǒng)計學(xué)差異。因此，烏賊墨黑色素不會對小鼠肝和腦的生長造成不良影響。

表1 小鼠臟器系數(shù)(n=5，/10-2)Table 1 Organ coefficient of mice(n=5，/10-2)

表1 小鼠臟器系數(shù)(n=5，/10-2)Table 1 Organ coefficient of mice(n=5，/10-2)

2.3 烏賊墨黑色素對鉛中毒小鼠肝臟、腦及血液的排鉛作用

小鼠染鉛30 min 后灌胃烏賊墨黑色素溶液(4 g/25 mL，0.2 mL)治療，結(jié)果見表2。鉛模型組小鼠肝鉛、腦鉛和血鉛含量上升顯著，與正常組相比差異極顯著(P＜0.01)，說明鉛模型建立成功。治療組小鼠肝鉛和血鉛含量與鉛模型組相比分別降低了49.47%和80.59%，差異極顯著(P＜0.01)，而腦鉛含量下降不明顯。

表2 染鉛30min 小鼠組織中的鉛含量(n=5，)Table 2 Lead content in mice tissues after 30 mins of lead poisoning (n=5，)

表2 染鉛30min 小鼠組織中的鉛含量(n=5，)Table 2 Lead content in mice tissues after 30 mins of lead poisoning (n=5，)

注:與正常組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與鉛模型組比較，Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01。Note:Compare with normal，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;Compare with model，Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01.

小鼠染鉛24 h 再灌胃烏賊墨黑色素，治療24 h后將小鼠處死，各組肝臟、腦及血液中的鉛含量見表3。鉛模型組中小鼠肝、腦和血液中的鉛含量與正常組相比，差異極顯著(P＜0.01)，與表2 中鉛模型組相比肝臟、腦及血液中的鉛含量上升了22.8%、100%和365.88%。而染鉛24h 治療組小鼠的肝、腦、血液中鉛的含量與鉛模型組相比分別下降了56.22 %、44.38 %和41.54 %，其中肝臟和血液中鉛含量差異極顯著(P＜0.01)，腦鉛含量差異顯著(P＜0.05)。

由表2、表3 的結(jié)果可得出烏賊墨黑色素能夠促進(jìn)染鉛24 h 以內(nèi)小鼠肝臟及血液排鉛。

表3 染鉛24h 小鼠組織中的鉛含量(n=5，)Table 3 Lead content in mice tissues after 24 h of lead poisoning(n=5，)

表3 染鉛24h 小鼠組織中的鉛含量(n=5，)Table 3 Lead content in mice tissues after 24 h of lead poisoning(n=5，)

注:與正常組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與鉛模型組比較，Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01。Note:Compare with normal，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;Compare with model，Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01.

2.4 鉛中毒模型分析

鉛中毒的模型有多種，有學(xué)者采用給大鼠飲用醋酸鉛水來建模，也有學(xué)者采用給大鼠喂鉛飼料的方法，本實(shí)驗?zāi)Ｐ褪菂㈤啽本┽t(yī)科大學(xué)中德聯(lián)合實(shí)驗室的方法［19］，采用腹腔注射醋酸鉛溶液，建立的小鼠鉛中毒模型。由表2 和表3 知鉛模型組的腦、肝和血液中鉛的含量均與正常組有顯著性差異，表明建模成功。

2.5 烏賊墨黑色素對鉛中毒小鼠解毒作用分析

由烏賊墨黑色素對鉛中毒小鼠的解毒實(shí)驗可知，小鼠腹腔注入高劑量的鉛離子后(染鉛30 min)血液與肝臟中的鉛含量上升顯著，染鉛24 h 后血液與肝臟中的鉛含量比染鉛30 min 時上升了365.88%與22.80 %。由此可以看出血液中鉛含量隨著時間變化明顯，是鉛中毒較為明顯的一個參考指標(biāo)。染鉛30 min 與24 h 后進(jìn)行烏賊墨黑色素灌胃治療，黑色素中的-COOH、-NH2、-OH 基團(tuán)與鉛離子絡(luò)合，與染鉛組比較，小鼠的肝臟和血液鉛含量下降顯著。表明烏賊墨黑色素對24 h 以內(nèi)鉛中毒小鼠有明顯的促排鉛作用。而長時間鉛中毒，臟器與血液中的鉛離子均有一定的蓄積，烏賊墨黑色素是否有顯著的治療效果，有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文初步研究了烏賊墨黑色素作為解毒劑對鉛中毒小鼠體內(nèi)鉛的清除效果。研究結(jié)果表明烏賊墨黑色素對小鼠的肝臟和腦生長無不良影響，是一種安全、天然的產(chǎn)物;鉛中毒小鼠于染毒30 min 或24 h 灌胃烏賊墨黑色素后，肝臟和血液中鉛的清除效果顯著(P＜0.01)。本文的研究結(jié)果可為開發(fā)治療鉛中毒的天然藥物提供一些科學(xué)依據(jù)。

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