譚韻雅，盧 紅，李 群*，魏 琴

1四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101;2 宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室，宜賓 644000

植物內(nèi)生菌是與其宿主在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中形成了互利互惠、無害或微害的寄生關(guān)系的菌群。目前研究植物內(nèi)生菌的生物學(xué)作用已逐漸成為熱點，對于內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的報道較多［1，2］。但直接從植物中分離得到的內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物普遍含量較低，不利于直接用于工業(yè)生產(chǎn)，需要對其進(jìn)行優(yōu)化［3，4］。優(yōu)化內(nèi)生菌的方式非常多，其中添加前體物質(zhì)等誘導(dǎo)物來促進(jìn)其產(chǎn)物的生產(chǎn)是一種常用且有效的方法［5，6］。

1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇、r-松油烯均是重要的天然產(chǎn)物，存在于多種植物精油之中，在醫(yī)藥、香料和日用化學(xué)品等方面均有重要的用途，有較高的經(jīng)濟價值［7，8］。目前多是直接從植物中提取來獲得這些物質(zhì)，但存在產(chǎn)量少，受季節(jié)限制等局限性。因此本研究試圖在產(chǎn)生這些天然產(chǎn)物的內(nèi)生菌中添加誘導(dǎo)物，探索不同培養(yǎng)條件下這些天然產(chǎn)物的產(chǎn)量，旨在提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)量。

本研究使用的內(nèi)生菌是游玲等［9，10］2009 年從油樟中分離得到的，且經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)生菌能生產(chǎn)1，8-桉葉油素等物質(zhì)。但其產(chǎn)量低，相對含量在8.5 %至16.7%之間，需優(yōu)化提高其產(chǎn)量。本研究使用的油樟油是一種天然的芳香油，用它作原料，可以得到許多重要的香料、香料參合劑或其它的化工產(chǎn)品［11］。本研究參照陶翠等［12］2011 年對油樟葉揮發(fā)油對幾種真菌的抗菌效果的報道，再加上前期的預(yù)實驗，以4%油樟油水濁液作為誘導(dǎo)劑添加在可產(chǎn)1，8-桉葉油素等物質(zhì)的幾種內(nèi)生菌中，探索油樟油對內(nèi)生菌產(chǎn)物的影響，旨在能提高1，8-桉葉油素等天然產(chǎn)物的產(chǎn)量，為這些產(chǎn)物能否工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。目前這方面的研究未見相關(guān)報道。

1 材料與儀器

1.1 材料

油樟內(nèi)生真菌YY26、YG42 和YG71 由宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室從宜賓市采集的油樟中分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200 g煮沸30 min 過濾，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水定容至1000 mL，pH 自然。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB):去皮馬鈴薯200 g 煮沸30 min 過濾，葡萄糖20 g，加水定容至1000 mL，pH 自然。察氏培養(yǎng)基:蔗糖30 g，硝酸鈉3 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，磷酸氫二鉀1 g，瓊脂12 g，水1000 mL，pH 自然。

1.3 主要試劑

1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇和r-松油烯四種標(biāo)品均由宜賓市舊州志林商貿(mào)有限責(zé)任公司江南香料化工廠提供。乙醇為色譜純級別。

1.4 儀器

氣相色譜儀［Agilent7890A、火焰離子化檢測器(FID)］，氣-質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 7890A/ 5975C)，超凈工作臺(SW-CJ-ZF)，恒溫培養(yǎng)搖床(THZ-300)，恒溫培養(yǎng)箱(BPH-9082)。

2 實驗方法

2.1 油樟內(nèi)生真菌的培養(yǎng)

從保藏的試管斜面挑取適量YY26、YG42 和YG71 菌種，分別接種于PDA 平板上活化，在長出的菌落邊緣取直徑6 mm 的菌絲塊3 塊，轉(zhuǎn)入裝有50 mL 培養(yǎng)液的搖瓶中，28 ℃，180 rpm 搖床培養(yǎng)8 d。

2.2 油樟油水濁液的制備

2.2.1 油樟葉揮發(fā)油的制備

新鮮油樟葉洗凈后剪碎至適當(dāng)粒度放入1 L 的圓底燒瓶中，用水蒸氣蒸餾法提取4 h，然后乙醚萃取、旋轉(zhuǎn)濃縮后用無水硫酸鈉干燥，得油樟葉揮發(fā)油。

2.2.2 混合乳化劑的制備

吐溫-80 和斯盤-80 按照7∶3 的比例混合，混合后于60 ℃水浴，然后充分?jǐn)嚢韬?。此混合乳化劑的HLB(親水親油平衡值)值為12.0(水包油乳化劑)。

2.2.3 油樟油水濁液的制備

先將油樟葉揮發(fā)油和乳化劑(HLB 值為12.0)按照1∶5 的比例混合，加入研缽中，順著一個方向充分研磨1 min 左右，再加入溶劑水繼續(xù)研磨，過濾滅菌后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實驗方案

在PDB 培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基中加入4%油樟油水濁液，再分別接入真菌YY26、YG42、YG71，同時設(shè)置相應(yīng)對照。每組實驗設(shè)三個重復(fù)，如表1。在28 ℃，180 rpm 搖床中培養(yǎng)8 d 后，將培樣瓶中的物質(zhì)均勻混合后取10 mL 放入頂空進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行GC-FID 檢測。采用外標(biāo)法定量。取其中產(chǎn)物較多的一組樣品進(jìn)一步做GC-MS 檢測，以此來確認(rèn)產(chǎn)物。

2.4 標(biāo)品的配制

分別稱取0.5 g 1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯標(biāo)品于50 mL 容量瓶中用乙醇定容，制成10 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取配好的10 g/L 的1，8-桉葉油素標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成濃度分別為50、20、5、1、0.5、0.1 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用以建立1，8-桉葉油素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取配好的10 g/L 的r-松油烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成濃度分別為1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用以建立r-松油烯的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別取配好的10 g/L 的a-松油醇和松油烯-4-醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋成濃度為10、5、1、0.5、0.05、0.01 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用以建立a-松油烯和松油烯-4-醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 GC-FID 檢測

色譜條件:HP-5(30 m ×250 μm ×0.25 μm)毛細(xì)管柱，平衡溫度90 ℃，平衡時間10 min。載氣為氮氣，氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min，氮氣尾吹氣25 mL/min，頂空不分流進(jìn)樣。柱箱程序:90 ℃保持4 min，然后5 ℃/min 到130 ℃保持5 min，然后5 ℃/min 到190 ℃保持3 min。

2.6 GC-MS 檢測

2.6.1 色譜條件

HP-5(30 m × 250 μm × 0.25 μm)毛細(xì)管柱;進(jìn)樣口溫度230 ℃;載氣為He 流量1 mL/min;分流比3∶1，分流流量3 mL/min。色譜柱程序升溫條件:初始溫度90 ℃保持4 min 然后5 ℃/min 到130 ℃保持5 min 然后5 ℃/min 到190 ℃保持3 min。

2.6.2 質(zhì)譜條件

離子源為EI 源，電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質(zhì)譜接口溫度280 ℃;質(zhì)量掃描范圍為m/z 35～400。

2.7 精密度和穩(wěn)定性試驗

取2.4 中配制好的10 g/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙醇為溶劑配制成10 mg/L 的混標(biāo)，取10 mL 于頂空進(jìn)樣瓶中，按2.5 方法重復(fù)進(jìn)樣5 次，計算1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積RSD(%);取同一供試品在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5 次，并連續(xù)進(jìn)樣3 天，計算1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯的峰面積日內(nèi)與日間RSD(%)。

2.8 回收率試驗

取2.4 中配制好的10 g/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙醇為溶劑配制成10、5、1 mg/L 的混標(biāo)，分別取5 mL 于頂空進(jìn)樣瓶中，再分別加入5 mL 已測樣品，依2.5 中方法測定，計算出回收率及RSD(%)。

2.9 統(tǒng)計分析

本實驗所有數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0 軟件進(jìn)行方差分析。

圖1 標(biāo)品(A)和樣品(B)的GC-FID 分析色譜圖Fig.1 GC-FID TICs of standard (A)and sampl (B)

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及樣品中物質(zhì)的確認(rèn)

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在2.5 色譜條件下，各個標(biāo)品以2.4 中所配制的濃度梯度進(jìn)樣，以進(jìn)樣濃度和峰面積進(jìn)行回歸分析，求得1，8-桉葉油素的回歸方程為Y=0.016X +0.0301，R2=0.9995;r-松油烯的回歸方程為Y=0.0127X+0.0016，R2=0.9992;松油烯-4-醇的回歸方程為Y=0.0346X +0.0286，R2=0.9996;a-松油醇的回歸方程為Y=0.0552X-0.0221，R2=0.9999。

3.1.2 樣品中物質(zhì)的確認(rèn)

幾種標(biāo)品的GC-FID 檢測結(jié)果如圖1A 所示。由圖1A 可知，標(biāo)品1，8-桉葉油素的出峰時間為5.134 min;r-松油烯的出峰時間為5.543 min;松油烯-4-醇的出峰時間為7.162 min;a-松油醇的出峰時間為7.383 min。圖1B 為樣品GC-FID 檢測的其中一個結(jié)果圖。比較圖1A 與圖1B 發(fā)現(xiàn)樣品在相近的時間出現(xiàn)與標(biāo)品相應(yīng)的峰，初步判斷樣品中有1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和a-松油醇。而r-松油烯未見出峰，可能沒有這個產(chǎn)物或該產(chǎn)物產(chǎn)量過低未被檢測出來。

樣品的GC-MS 檢測結(jié)果顯示，樣品中1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖相對比，匹配度分別達(dá)到98%、89%、90%，證明樣品中相應(yīng)峰所對應(yīng)物質(zhì)確實與標(biāo)品為同一物質(zhì)。

3.2 精密度和穩(wěn)定性試驗結(jié)果

精密度試驗中1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積RSD(%)分別為2.69、1.23、1.42、1.96，表明進(jìn)樣過程中進(jìn)樣量基本一致;穩(wěn)定性試驗中1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯的峰面積日內(nèi)RSD(%)分別為1.99、2.12、2.11、1.59，日間RSD(%)分別為3.44、2.89、4.12、3.16，表明供試品溶液在所測時間內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.3 回收率試驗結(jié)果

2.8試驗中1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯的平均回收率(n=3)分別為101.22%，100.34 %，98.97 %，103.01 %;RSD(%)分別為2.89，1.71，1.99，2.62。

3.4 GC-FID 檢測結(jié)果

通過GC-FID 檢測，明確了各標(biāo)本吸收峰的出峰時間。通過標(biāo)品與樣品GC-MS 質(zhì)譜檢測，確定樣品中相同出峰時間的物質(zhì)與相應(yīng)的標(biāo)品為同一物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上對所有實驗處理進(jìn)行了GC-FID 檢測，結(jié)果如表1 所示。

3.4.1 未加油樟油時內(nèi)生菌中天然產(chǎn)物含量情況

從表1 可知，在未加油樟油的處理中(即3、4、5、9、10、11 處理)，三種菌均能生成1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇，不能生成r-松油烯。其中不同菌株在不同培養(yǎng)基中均表現(xiàn)為1，8-桉葉油素的產(chǎn)量最高，最高產(chǎn)量可達(dá)0.18 mg/L(9、10 處理);其次為松油烯-4-醇，其最高產(chǎn)量為0.08 mg/L(4 處理);a-松油醇的產(chǎn)量最低，其最高產(chǎn)量僅為0.05 mg/L(4 處理)。

未加油樟油的處理組之間的對比發(fā)現(xiàn)(即3、4、5 之間相互比較;9、10、11 之間相互比較):在PDB培養(yǎng)基中，1，8-桉葉油素產(chǎn)量最高的是YG71 菌株，產(chǎn)量可達(dá)0.16 mg/L，其次是YY26 菌株，YG42 菌株的產(chǎn)量最低;對松油烯-4-醇和a-松油醇的產(chǎn)量來說，最高的均是YG42 菌株，產(chǎn)量分別可達(dá)0.08 mg/L 和0.05 mg/L;YY26 菌株的產(chǎn)量次之，YG71 菌株的產(chǎn)量最低。在察氏培養(yǎng)基中，YG42 和YY26 菌株的1，8-桉葉油素產(chǎn)量較高，產(chǎn)量均為0.18 mg/L，YG71 菌株的產(chǎn)量較低;YG42 和YG71 菌株中松油烯-4-醇和a-松油醇產(chǎn)量均相同且較高，分別為0.07 mg/L 和0.02 mg/L，YY26 菌株的產(chǎn)量較低。

由此可見，對未加油樟油的PDB 培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基中內(nèi)生菌產(chǎn)物進(jìn)行對比分析得出:除YG42菌株中松油烯-4-醇和a-松油醇產(chǎn)量PDB 培養(yǎng)基比察氏培養(yǎng)基中的產(chǎn)量高外，其余均是察氏培養(yǎng)基中的產(chǎn)量更高，即察氏培養(yǎng)基的產(chǎn)物總量高于PDB 培養(yǎng)基中的產(chǎn)物總量。

3.4.2 加油樟油后內(nèi)生菌中天然產(chǎn)物含量情況

由表1 可知，在PDB 培養(yǎng)基中，加入油樟油后，YY26 和YG42 菌株中1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇的產(chǎn)量均增加，表明油樟油對YY26 和YG42 菌株中的三種目標(biāo)產(chǎn)物均有促進(jìn)的作用。其中對1，8-桉葉油素的促進(jìn)作用最強，在YY26 菌株中產(chǎn)量提高了1.41 倍，YG42 菌種中產(chǎn)量提高了1.30 倍，與僅加油樟油的處理相比(1 處理)有極顯著的差異;其次對松油烯-4-醇和a-松油醇也有促進(jìn)作用，只是提高倍數(shù)較小，最高僅有0.38 倍。與僅加油樟油的處理相比，仍達(dá)到了顯著水平以上(見表2);而在YG71 菌株中，加入油樟油后，1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇的產(chǎn)量均被抑制，與僅加油樟油的處理相比，分別減少0.27、0.31、0.34倍，均達(dá)到顯著水平以上(見表2)。

察氏培養(yǎng)基中，加入油樟油后，YY26 菌株中1，8-桉葉油素的產(chǎn)量減少，減少了0.19 倍，與僅加油樟油的處理相比有顯著性差異;松油烯-4-醇和a-松油醇的產(chǎn)量均增加，但與僅加油樟油的處理相比沒有顯著性差異;YG42 菌株中1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇的產(chǎn)量均增加，a-松油醇的產(chǎn)量減少，與僅加油樟油的處理相比均無顯著性差異;YG71 菌株中1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇的產(chǎn)量均減少，與僅加油樟油的處理相比1，8-桉葉油素的產(chǎn)量有及顯著性差異，松油烯-4-醇的產(chǎn)量有顯著性差異，a-松油醇的產(chǎn)量則無顯著性差異，分別減少0.45 倍、0.18 倍0.03 倍。

由此可見，對加了油樟油的PDB 培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基中內(nèi)生菌產(chǎn)物進(jìn)行對比分析得出:除YG71 菌株中松油烯-4-醇和a-松油醇的產(chǎn)量察氏培養(yǎng)基比PDB 培養(yǎng)基高外，其余均是PDB 培養(yǎng)基中的產(chǎn)量更高，即PDB培養(yǎng)基中的產(chǎn)物總量比察氏培養(yǎng)基的產(chǎn)物總量高。這與未加油樟油的處理組結(jié)果完全不同。

表1 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物GC 檢測結(jié)果Table 1 GC detection result for the endophytic fungi metabolites

注:“-”表示不添加:“+”表示添加;與1 處理相比，a0.001＜P＜0.05;aaP＜0.001。Note:″-″ means not added;″+″ means added;compared with 1 treatment，a0.001＜P＜0.05;aaP＜0.001.

表2 油樟油對內(nèi)生真菌中1，8-桉葉油素等產(chǎn)物的提升倍數(shù)Table 2 The multiple of the 4 investigated compounds promoted by C.longepaniculatum oil in endophytic fungi

4 討論

在本研究中，采用了GC-MS 和GC-FID 兩種檢測方式，是因為本實驗所用GC-MS 的最低檢測線較高。而本實驗中部分樣品的物質(zhì)含量較低，用GCMS 無法檢測，因此采用GC-FID 檢測。同時再選擇幾組含量較高的樣品來做GC-MS 檢測，以此定性。得到的實驗結(jié)果如正文所描述。

眾所周知，培養(yǎng)基與誘導(dǎo)物均是影響微生物代謝產(chǎn)物的重要因素。近幾年有大量關(guān)于優(yōu)化培養(yǎng)基來提高微生物代謝產(chǎn)物的報道［13，14］，也有許多通過添加誘導(dǎo)物來促進(jìn)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提高的報道［15，16］。本實驗中未加油樟油的PDB 培養(yǎng)基與察氏培養(yǎng)基相比，察氏培養(yǎng)基的1，8-桉葉油素等物質(zhì)積累更多;而加了油樟油的PDB 培養(yǎng)基與察氏培養(yǎng)基相比，PDB 培養(yǎng)基的1，8-桉葉油素等物質(zhì)積累更多?？梢酝茢嗯囵B(yǎng)基和誘導(dǎo)物對內(nèi)生菌產(chǎn)物產(chǎn)量均有影響，且它們之間存在交互影響。

在PDB 培養(yǎng)基中，加入油樟油和不加油樟油的實驗結(jié)果表明，油樟油可促進(jìn)YY26、YG42 菌株中積累1，8-桉葉油素，并且積累量分別提高1.41 倍和1.30 倍。有人做過類似的研究，得到類似的結(jié)果，如吳欣證明滑桃樹種子提取物能提高其內(nèi)生菌Streptomyces sp.WXC 菌株中富倫菌素B 的產(chǎn)量［6］，同時證實是因為滑桃樹種子提取物作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)了活性化合物富倫菌素B 生物合成基因的表達(dá)。本實驗中油樟油作為誘導(dǎo)物，在YY26 和YG42 菌株中促進(jìn)1，8-桉葉油素產(chǎn)量的提高，是否也是誘導(dǎo)了1，8-桉葉油素生物合成基因的表達(dá)，還有待進(jìn)一步探討。另外，對YG71 菌株來說，在PDB 培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基中1，8-桉葉油素均被抑制，推測可能是YG71 利用油樟油中的1，8-桉葉油素將其轉(zhuǎn)化為了其它物質(zhì)或者其它原因。Rodríguez P［17］等曾做過關(guān)于微生物對1，8-桉葉油素的生物轉(zhuǎn)化，結(jié)果證實1，8-桉葉油素被轉(zhuǎn)化為2-氧-1，8-桉葉油素等物質(zhì)。

本實驗初步證明通過添加誘導(dǎo)物或培養(yǎng)基的優(yōu)化等手段可增加油樟內(nèi)生菌中1，8-桉葉油素等物質(zhì)的積累，之后的工作就可從這方面繼續(xù)做進(jìn)一步的研究。該研究為這些天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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