原 琳，李 嬌，榮永海，仝戰(zhàn)旗，榮 龍*

1北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191;2 解放軍總醫(yī)院，北京 100853

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)屬于蘭科石斛屬，是一種多年生附生草本植物。鐵皮石斛可入藥，為名貴中藥鐵皮楓斗的原植物，具有益胃生津，滋陰清熱等多種功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、抗氧化、促進(jìn)消化、降血糖、降血壓等作用［1］。鐵皮石斛中含有多種化學(xué)成分，包括氨基酸、多糖、生物堿、菲類化合物等［2］。從石斛中分離得到的生物堿叫做石斛堿，為堿性的含氮有機(jī)化合物。研究表明，石斛堿為石斛的主要有效成分之一。石斛堿種類繁多，并具有多種生理活性，包括:降血壓、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛及抗菌抗瘧等。石斛堿的抗腫瘤活性已在動物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，且石斛堿相較其他抗腫瘤藥具有低毒性、低成本的特點(diǎn)，因此生物堿的提取純化已成為近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn)。此外，鐵皮石斛中還含有高達(dá)18.20 %的多糖。鐵皮石斛多糖主要具有抗氧化及增強(qiáng)免疫力等生理功能。同時(shí)，鐵皮石斛多糖也具有抗腫瘤的功效，可以抑制肝癌HepG2 細(xì)胞及人宮頸癌HelaS3 細(xì)胞的生長［3］。

鐵皮石斛中的生物堿和多糖均為重要的功能化合物。以往的研究［4-7］基本僅分離提取鐵皮石斛中的單一活性成分，導(dǎo)致鐵皮石斛原材料的極大浪費(fèi)。因此，生物堿和多糖的聯(lián)合提取對于鐵皮石斛資源的綜合利用來說具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究應(yīng)用了閃式提取法這一新型提取技術(shù)，具有溫和、高效、節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究［8-11］將其用于多種原材料活性成分的分離提取，均取得了良好的效果。本研究探討了利用閃式提取技術(shù)從鐵皮石斛中聯(lián)合提取生物堿及多糖的工藝方法，并對工藝中的酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與儀器

鐵皮石斛冷凍鮮品(原料干重以原料鮮重13.78%計(jì))，由江門市鴻豪實(shí)友生物有限公司提供。纖維素酶:北京鴻潤寶順科技有限公司，2000 U/g;木瓜蛋白酶:北京鴻潤寶順科技有限公司，980000 U/g;石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品:中國食品藥品檢定研究院，99.8%;溴甲酚綠:天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，pH 值變色范圍3.8(黃綠)～5.4(藍(lán));乙腈:J＆K，色譜純;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑;水為雙蒸水。

高精度磁浮天平，BELENGINEER;閃式提取器:JHBE-50 型，河南金鼎科技發(fā)展有限公司;低速臺式離心機(jī):TDL-5-A 型，上海安亭科學(xué)儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;DHG-9071A 型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:RE-52AA 型，上海亞榮生化儀器廠;紫外可見分光光度計(jì):SP-756 型，上海光譜儀器有限公司;高效液相色譜儀:600 型，Waters;液相色譜儀:1200 系列，安捷倫科技有限公司;示差折光檢測器:Knauer。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 生物堿測定

生物堿測定采用酸性染料比色法。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用氯仿溶解，用容量瓶定容至100 mL，以配制成10 μg/mL 的石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5 mL 置于分液漏斗中，用氯仿稀釋至10 mL。分別加入pH 4.5 的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5 mL 及0.04%溴甲酚綠2 mL，劇烈振搖3 min，室溫下靜置30 min。將氯仿層用藥棉濾過，取續(xù)濾液5 mL，加入0.01 mol/L NaOH-乙醇溶液1 mL，搖勻。用分光光度計(jì)在620 nm 下測定其吸光度，由吸光度A 對濃度C(μg/mL)進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=-0.0019 +0.1651C，R2=0.9992。

2.1.2 樣品的測定

精密稱取本實(shí)驗(yàn)制得的生物堿樣品50 mg 置于100 mL 容量瓶中，用氯仿溶解并定容至100 mL。取10 mL 置于分液漏斗中，其余按“2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。

2.2 多糖測定

多糖測定采用苯酚-硫酸比色法［12］。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg 置于100 mL 容量瓶中，加水溶解，并定容至刻度，以配置成200 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。將此標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至20、40、60、80、100、120 μg/mL，各濃度稀釋液各取1 mL 置于具塞試管中，分別加入5%苯酚溶液1 mL，震蕩混勻后立即加入濃硫酸5 mL，混勻后在100 ℃下水浴20 min，冰浴5 min。用分光光度計(jì)在488 nm 下測定顯色后溶液的吸光度，由吸光度A 對濃度C(μg/mL)進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=-0.0046 +0.0081 C，R2=0.9992。

2.2.2 樣品的測定

精密稱取本實(shí)驗(yàn)制得的多糖樣品20 mg 置于100 mL 容量瓶中，加水溶解至刻度，取1.0 mL 置于具塞試管中，其余按“2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。

2.3 聯(lián)合提取方法

2.3.1 生物堿的提取

稱取一定量的鐵皮石斛冷凍鮮品，剪碎，加入8倍體積無水乙醇，以3500 rpm 閃提1 min，間隔1 min，再閃提1 min。以5000 rpm，離心15 min。取沉淀，加入15 倍體積水，以4000 rpm 閃提1 min，間隔1 min，再閃提1 min。以5000 rpm，離心15 min。加水浸沒沉淀，真空抽濾，重復(fù)3～4 次，洗凈沉淀，即得到鐵皮石斛粗渣。向鐵皮石斛粗渣中加50 倍體積水，加入16 U/g 纖維素酶和19600 U/g 木瓜蛋白酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50 ℃下酶解2 h 后過濾。用水洗凈濾渣。取洗凈的濾渣，在真空干燥箱中干燥，之后加入氨水和6 mol/L NaOH溶液堿化。加入3 倍體積丙酮，回流5～8 h 進(jìn)行脫脂。過濾，取濾渣，用三氯甲烷充分提取其中的生物堿。過濾后取濾液置于蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上將其中的三氯甲烷蒸干。用甲醇將生物堿溶解，離心后取沉淀，待其自然干燥便得到生物堿。

2.3.2 結(jié)合多糖的提取

取第一次過濾后得到的濾液，與第二次水洗沉淀得到的洗液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10。加入乙醇達(dá)80%質(zhì)量百分濃度，在-20 ℃下靜置醇沉1 h。以5000 rpm，離心15 min。取沉淀，經(jīng)無水乙醇、丙酮和乙醚三次脫水，干燥后便得到結(jié)合多糖。

2.3.3 游離多糖的提取

取第二次離心后得到的上清，與第一次水洗沉淀得到的洗液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10。加入乙醇達(dá)80%質(zhì)量百分濃度，在-20 ℃下靜置醇沉1 h。以5000 rpm，離心15 min。取沉淀，經(jīng)無水乙醇、丙酮和乙醚三次脫水，干燥后便得到游離多糖。

2.4 酶解條件的優(yōu)化

2.4.1 料液比對生物堿及多糖提取率的影響

取一定量的鐵皮石斛粗渣，平均分成5 份，分別加入20、30、40、50、60、70 倍體積水，同時(shí)加入20 U/g 纖維素酶和19600 U/g 木瓜蛋白酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50 ℃下酶解2 h，過濾后分別測定料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70時(shí)，濾渣中生物堿及上清中多糖的提取率。綜合分析后確定酶解的最佳料液比。

2.4.2 纖維素酶添加量對生物堿及多糖提取率的影響

取一定量的鐵皮石斛粗渣，平均分成5 份，分別加入8、16、24、32、40、48 U/g 纖維素酶，同時(shí)加入50倍體積水和19600 U/g 木瓜蛋白酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50 ℃下酶解2 h，過濾后分別測定纖維素酶添加量為8、16、24、32、40、48 U/g時(shí)，濾渣中生物堿及上清中多糖的提取率。綜合分析后確定酶解的最佳纖維素酶添加量。

2.4.3 木瓜蛋白酶添加量對生物堿及多糖提取率的影響

取一定量的鐵皮石斛粗渣，平均分成5 份，分別加入9800、19600、29400、39200、49000、58800 U/g木瓜蛋白酶，同時(shí)加入50 倍體積水和20 U/g 纖維素酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50 ℃下酶解2 h，過濾后分別測定木瓜蛋白酶添加量為9800、19600、29400、39200、49000、58800 U/g 時(shí)，濾渣中生物堿及上清中多糖的提取率。綜合分析后確定酶解的最佳木瓜蛋白酶添加量。

2.4.4 酶解時(shí)間對生物堿及多糖提取率的影響

取一定量的鐵皮石斛粗渣，平均分成5 份，分別加入50 倍體積水、20 U/g 纖維素酶和19600 U/g 木瓜蛋白酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50℃下分別酶解1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，過濾后分別測定酶解時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3、3.5 h 時(shí)，濾渣中生物堿及上清中多糖的提取率。綜合分析后確定最佳酶解時(shí)間。

2.5 產(chǎn)品得率及純度的計(jì)算方法

2.6 生物堿HPLC 檢測

2.6.1 色譜條件

色譜柱為Waters SunFireTMC18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相為乙腈:0.1%三乙胺=40∶60;流速為1 mL/min;柱溫為室溫;檢測波長為240 nm;進(jìn)樣量為20 μL。

2.6.2 石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品檢測

準(zhǔn)確稱取石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g，用乙腈溶解，定容至10 mL。用上述色譜條件進(jìn)行檢測。

2.6.3 生物堿樣品檢測

準(zhǔn)確稱取本工藝制得的生物堿樣品50 mg，用乙腈溶解，定容至10 mL。用上述色譜條件進(jìn)行檢測。

2.7 多糖分子量測定

制得的多糖分子量通過凝膠滲透色譜(Gel permeation chromatography，GPC)測定，采用彭鋒［13］等人的方法。色譜條件:色譜柱為PL aquagel-OH 50柱(300 mm ×7.7 mm，Polymer Laboratories 有限公司);流速保持在0.5 mL/min;洗脫劑為含20 mmol/L NaCl 的5 mmol/L PBS 緩沖液(pH 值為7.5);柱溫為30 ℃。使用PL 支鏈淀粉(分子量分別為783、12200、100000、1600000 Da，Polymer Laboratories 有限公司)作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)。樣品用含20 mmol/L NaCl 的5 mmol/L PBS 緩沖液(pH 值為7.5)溶解配制。

3 結(jié)果與討論

3.1 酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

不同酶解料液比對生物堿及多糖提取率的影響如圖1(A)所示。隨著加水比例的增大，細(xì)胞吸水脹破，生物堿的提取率顯著增大，在料液比為1∶30時(shí)生物堿提取率達(dá)到最大，之后隨著加水比例的增大逐漸減小，可能原因是，加水使纖維素酶及木瓜蛋白酶被大幅度稀釋，破壞其保持穩(wěn)定所需的條件，因此，兩種酶的酶解能力均下降，無法溶解細(xì)胞壁，由于細(xì)胞壁的保護(hù)作用，防止了細(xì)胞脹破。多糖提取率起初處于較高水平，可能原因是細(xì)胞壁酶解產(chǎn)生了部分多糖，使多糖測定結(jié)果偏高。之后隨著加水比例的增大，多糖提取率逐漸減小，其原因與生物堿提取率減小相同，料液比達(dá)到1∶40 后，多糖提取率趨于穩(wěn)定。綜上，可選擇1∶30 作為最適酶解料液比，此時(shí)生物堿提取率最大，且多糖提取率也較高。

不同纖維素酶添加量對生物堿及多糖提取率的影響如圖1(B)所示。生物堿提取率隨著纖維素酶添加量的增加而增大，在纖維素酶添加量為24 U/g時(shí)，生物堿的提取率達(dá)到最大，之后趨于平緩。多糖提取率隨著纖維素酶添加量的增加顯著增大，在纖維素酶添加量達(dá)到32 U/g 時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最大，而后稍有下降。綜上，可選擇32 U/g 作為最適纖維素酶添加量，此時(shí)多糖提取率最大，而生物堿提取率也保持在最高水平。

不同木瓜蛋白酶添加量對生物堿及多糖提取率的影響如圖1(C)所示。生物堿提取率隨著木瓜蛋白酶添加量的增加而增大，在木瓜蛋白酶添加量為19600 U/g 時(shí)，生物堿的提取率達(dá)到最大，之后趨于穩(wěn)定，增加木瓜蛋白酶添加量生物堿提取率也不再增大。多糖提取率隨著木瓜蛋白酶添加量的增加而逐漸增大，在木瓜蛋白酶添加量達(dá)到39200 U/g 之后，多糖提取率趨于穩(wěn)定，再增加木瓜蛋白酶添加量多糖提取率僅有少量增大。綜上，可選擇39200 U/g 作為最適木瓜蛋白酶添加量，此時(shí)生物堿提取率處于最高水平，而多糖提取率也處于較高水平。

不同酶解時(shí)間對生物堿及多糖提取率的影響如圖1(D)所示。生物堿提取率隨著酶解時(shí)間的增加而增大，在酶解時(shí)間延長到1.5 h 后，生物堿提取率開始趨于平緩。多糖提取率隨著木瓜蛋白酶添加量的增加而逐漸增大，在酶解時(shí)間達(dá)到2.5 h 之后，多糖提取率趨于平緩。綜上，可以選擇2.5 h 作為酶解的最適時(shí)間。在此酶解時(shí)間下，生物堿及多糖提取率均在較高水平，且可以節(jié)省工藝時(shí)間和能源，提高提取效率。

圖1 不同料液比(A)、纖維素酶添加量(B)、木瓜蛋白沒添加量(C)及酶解時(shí)間(D)對生物堿及多糖提取率的影響Fig.1 Effect of material/solvent ratio(A)，amount of cellulose added(B)，amount of papain added(C)，and hydrolysis time (D)on the extraction yields of alkaloid and polysaccharide

3.2 各成分測定結(jié)果

用最優(yōu)工藝條件所提取的各成分定量測定結(jié)果見表1。

人工種植的鐵皮石斛中總生物堿含量約為0.0190%～0.0430%，而野生一年生鐵皮石斛總生物堿含量約為0.0343%，不同品種和生長年限的鐵皮石斛生物堿含量基本在一個(gè)固定的范圍內(nèi)變動［14］。研究報(bào)道，野生鐵皮石斛中多糖含量約為20.98%～22.32%，而組織培養(yǎng)的鐵皮石斛中多糖含量約為20.65%～22.18%。本實(shí)驗(yàn)所提取的生物堿質(zhì)量占原料濕重的0.01875%，同時(shí)，由表1 可知，本工藝所提取的總多糖得率為23.5%。因此，本工藝方法對鐵皮石斛中的生物堿及多糖進(jìn)行了有效提取。另外，所提取的生物堿、結(jié)合多糖及游離多糖的純度分別達(dá)到了78.2%、81.3%及90.6%。綜上，本工藝成功從鐵皮石斛中聯(lián)合提取了生物堿和多糖兩種物質(zhì)，且保證了各成分的得率和純度，提高了鐵皮石斛原材料的利用率。

表1 鐵皮石斛中各成分定量測定結(jié)果Table 1 Quantitative determination of products

3.3 生物堿HPLC 檢測

石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品及本工藝所制得的生物堿樣品的HPLC 色譜圖如圖2 所示，結(jié)果表明，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間基本相同，因此，本工藝所提取分離的生物堿可基本確定為石斛堿。

圖2 石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品及鐵皮石斛生物堿樣品的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of dendrobine standard (A)and D.officinale alkaloid sample (B)

3.4 多糖分子量測定

如圖3 所示，本研究所制得的多糖經(jīng)GPC 分析，得到結(jié)合多糖及游離多糖的重均分子量分別為2373Da、17987Da。

圖3 凝膠滲透色譜測定結(jié)合多糖(A)及游離多糖(B)分子量結(jié)果Fig.3 GPC chromatograms of joint polysaccharide(A)and free polysaccharide(B)

4 結(jié)論

本研究利用閃式提取、酶解等方法成功從鐵皮石斛中聯(lián)合提取了生物堿及多糖兩種生物活性成分，對于鐵皮石斛這種珍貴中藥材的綜合利用具有重要意義。利用本研究所確定的提取方法及提取條件所得到的生物堿、多糖具有較高的提取率及純度。此工藝方法簡單高效、節(jié)約能源及試劑。綜上，本方法適于在工業(yè)化生產(chǎn)中推廣，從鐵皮石斛中的提取得到的生物堿及多糖具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 Lv GY(呂圭源)，Yan MQ(顏美秋)，Chen SH(陳素紅).Review of pharmacological activities of Dendrobium officinale based on traditional functions.Chin J Chin Mater Med (中國中藥雜志)，2013，38:489-493.

2 Tu GC(屠國昌).Chemical composition，pharmacological effects and clinical applications of Dendrobium officinale.Strait Phar J (海峽藥學(xué))，2010，22:70-71.

3 Sheng JR(盛家榮)，Li ZH(李志華)，Yi YB(易艷波)，et al.Advances in the study of polysaccharide from Dendrobium officinale.J Guangxi Acad Sci (廣西科學(xué)院學(xué)報(bào))，2011，04:338-340.

4 Zhou ST(周術(shù)濤)，Lei ZL(雷志力)，Yu QX(俞巧仙)，et al.Study on the preferred extraction of polysaccharides from dendrobium cadidum with uniform design and orthogonal design.Sci Tech Food Ind (食品工業(yè)科技)，2010，11:296-297.

5 Huang XJ(黃曉君)，Nie SP(聶少平)，Wang YT(王玉婷)，et al.Optimized Extraction and compositional analysis of polysaccharides from dried stems of Dendrobium officinale.J Food Sci (食品科學(xué))，2013，22:21-26.

6 Wu Y(武蕓)，Deng JQ(鄧潔群)，Yang T(楊婷)，et al.Optimization of extraction of water-soluble polysaccharides from tissue culture seedling of Dendrobium officinale.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，12:1709-1714.

7 Hu JM(胡建楣)，Li JL(李靜玲)，F(xiàn)eng P(馮鵬)，et al.Optimization of enzymatic extraction of polysaccharide from Dendrobium officinale by Box-Behnken design and response surface methodology.Chin Med Mat (中藥材)，2014，01:130-133.

8 Li J(李嬌)，Rong YH(榮永海)，Rong L(榮龍).Flash extraction of polysaccharide from Dendrobium officinale.Chin Med Mat (中藥材)，2013，09:1524-1527.

9 Liu J(劉靜)，Rong YH(榮永海)，Wang ZB(王志濱)，et al.Continuous extraction and separation of active ingredients of mangosteen.Chin Med Mat(中藥材)，2010，4:629-632.

10 Liao Y(廖怡)，Rong YH(榮永海)，Rong L(榮龍).Combined extraction of superoxide dismutase and catalase from earthworm Eisenia fetida.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，11:1538-1544.

11 Shang GN(商桂娜)，Rong YH(榮永海)，Rong L(榮龍).Extraction and purification of GSH-Px from earthworm.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，1:76-82.

12 Fan YN(樊懿娜)，Zhao T(趙婷)，Zhou Y(周葉)，et al.Determination of polysaccharide content in Grifola frondosa by phenol-sulferic acid method.J Anhui Agri Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2011，25:15256-15257.

13 Peng F，Ren JL，Xu F，et al.Comparative study of hemicelluloses obtained by graded ethanol precipitation from sugarcane bagasse.J Agric Food Chem，2009，14:6305-6317.

14 Zhu Y(諸燕)，Zhang AL(張愛蓮)，He BW(何伯偉)，et al.Quantitive variation of total alkaloids contents in Dendrobium officinale.Chin J Chin Mater Med (中國中藥雜志)，2010，18:2388-2391.