王志宏，彭 勝，雷明盛，2，3，鄭 陽，史麗娟，周云雷，彭密軍

1 吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杜仲湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，張家界 427000;2武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢 430071;3 湖南省張家界市人民醫(yī)院，張家界 427000

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是杜仲科杜仲屬植物，因其具有“三降六抗一增”功效而成為我國(guó)特有的名貴滋補(bǔ)藥材［1］。它富含多種活性成分，如黃酮類、木脂素類、苯丙素類和環(huán)烯醚萜類等。其中黃酮類物質(zhì)有明顯的保護(hù)心血管、抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)免疫以及抗腫瘤等功效［2］。我國(guó)杜仲種植范圍廣泛，杜仲葉資源豐富易得，且杜仲葉中總黃酮含量較高。研究表明，杜仲葉富含多種黃酮:槲皮素、山奈酚、山奈酚-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基-(1→2)-阿拉伯糖苷或槲皮素-3-O-木糖基-(1→2)-葡萄糖苷等［6，7］。但在消化、吸收和代謝過程中，黃酮苷元比黃酮苷的效價(jià)高［3-5］。趙德義［8］等人通過比較杜仲黃酮和銀杏黃酮的HPLC 指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，杜仲黃酮苷元主要為槲皮素和山奈酚。酸水解可將糖苷水解為對(duì)應(yīng)的苷元，而聚酰胺樹脂對(duì)含酚羥基化合物的富集純化效果較好，為富集總黃酮的理想材料，采用聚酰胺樹脂富集杜仲總黃酮的條件較為成熟［9］，但是對(duì)杜仲黃酮苷元的富集工藝卻很少見報(bào)道。本研究參考《中國(guó)藥典》中銀杏黃酮的水解工藝，對(duì)杜仲黃酮的水解工藝進(jìn)行考察［10］，進(jìn)而考察苷元的富集工藝，以期為杜仲葉資源優(yōu)勢(shì)向經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化尋找有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

杜仲葉于2013 年11 月份采集于吉首大學(xué)張家界校區(qū)，經(jīng)廖博儒研究員鑒定為杜仲;將采集的矮林杜仲葉，經(jīng)微波殺青，50 ℃烘干，粉碎，過80 目篩，備用;槲皮素(Quercetin，批號(hào)YA0806YB13，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，HPLC);山奈酚(Kaempferol，批號(hào)20130329，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，HPLC);甲醇為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);聚酰胺樹脂(60～100目)、鹽酸、氫氧化鈉、醋酸、95%乙醇等均為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

LC-20A 高效液相色譜儀，日本島津;U-3900 紫外分光光度計(jì)，日本HITCHI 公司;BM400 型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋，日本YAMATO;AEL-405M 型萬分之一天平，日本SHIMADZU;GZX-9146-MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 杜仲黃酮苷元HPLC 檢測(cè)條件

高效液相色譜條件:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸(63∶37);檢測(cè)波長(zhǎng):370 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量20 μL［11］。

1.3.2 杜仲黃酮苷元TLC 檢測(cè)條件

薄層色譜檢測(cè)條件:展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶3∶1)，顯色劑為1%三氯化鋁-乙醇溶液，顯色、晾干后置于紫外燈365 nm 下檢測(cè)［12］。

1.3.3 杜仲葉提取物樣品制備方法

取適量杜仲葉樣品，加入95%乙醇，超聲輔助提取60 min，過濾，濾液保存?zhèn)溆?濾渣再用60%乙醇以1∶20(g/mL)料液比超聲輔助提取60 min，過濾;合并兩次濾液，減壓濃縮、冷凍干燥，得杜仲葉提取物［13］。

1.3.4 水解杜仲黃酮單因素與正交試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)以黃酮苷元槲皮素和山奈酚總和為考察指標(biāo)。準(zhǔn)確稱取20 mg 杜仲葉提取物，經(jīng)參考相關(guān)文獻(xiàn)及在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上［14，15］，確定單因素考察如下:料液比(mg/mL)為4∶1、3.5∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1 和1∶1，水解時(shí)間考察范圍為2、3、4、5、6 h，水解溫度考查范圍為50、60、70、80、90 ℃，鹽酸濃度為3、4、5、6、7、8 mol/L。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)，確定水解杜仲黃酮制備黃酮苷元的最佳工藝，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 黃酮苷元的富集工藝

在最佳工藝條件下制備適量的杜仲葉黃酮苷元樣品，減壓濃縮后水洗至中性;用甲醇洗滌濾餅，收集濾液，薄層色譜檢測(cè)至無目標(biāo)物止。將濾液與適量聚酰胺樹脂混合，進(jìn)行充分的靜態(tài)吸附，混合裝柱，再經(jīng)梯度洗脫，薄層色譜跟蹤檢測(cè)，收集相同洗脫液，合并、減壓濃縮、冷凍干燥得粗樣品，HPLC 法測(cè)其含量;然后將所得粗產(chǎn)品通過干法上樣進(jìn)行聚酰胺二次富集，HPLC 跟蹤檢測(cè)，收集相同洗脫液，合并、減壓濃縮、冷凍干燥得純化樣品，測(cè)定樣品中黃酮苷元含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)水解的影響

在70 ℃條件下，以甲醇∶鹽酸為4∶1，鹽酸濃度為6 mol/L，將料液比(mg/mL)設(shè)為4∶1、3.5∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1 和1∶1，水解4 h，結(jié)果見圖1(A)。隨料液比比例增加，水解所得黃酮苷元的含量呈增加趨勢(shì)，但當(dāng)料液比達(dá)到2∶1 之后，苷元含量基本趨于平穩(wěn)。原因可能是料液比較大時(shí)，水解反應(yīng)及物質(zhì)的溶解在體系中不充分;當(dāng)溶劑比例提高到一定程度，即料液比較小時(shí)，雖然反應(yīng)較為徹底，但體系中酸含量的增大又會(huì)對(duì)苷元造成影響，并從節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本角度出發(fā)，所以將實(shí)驗(yàn)料液比選為2∶1(mg/mL)。

2.1.2 水解溫度對(duì)水解的影響

以料液比為2∶1(mg/mL)，甲醇∶鹽酸為4∶1，鹽酸濃度為6 mol/L，溫度為50、60、70、80、90 ℃，水解4 h，考察不同水解溫度對(duì)水解黃酮苷元含量的影響，結(jié)果見圖1(B)。由圖可知，隨溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于水解反應(yīng)的進(jìn)行，但是溫度過高，副反應(yīng)增加，雜質(zhì)相應(yīng)增多。綜合考慮，確定水解溫度為70 ℃左右。

2.1.3 水解時(shí)間對(duì)水解的影響

按照水解條件，以料液比為2∶1(mg/mL)，甲醇∶鹽酸為4∶1，鹽酸濃度為6 mol/L，水解溫度為70℃，水解時(shí)間分別為2、3、4、5、6 h，進(jìn)行水解，考察不同水解時(shí)間對(duì)水解得黃酮苷元含量的影響，結(jié)果見圖1(C)。由圖可得，水解4 h 時(shí)，苷元的含量達(dá)到最大值，當(dāng)水解反應(yīng)時(shí)間較短時(shí)，水解不充分;水解時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，在體系中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物從而影響苷元的含量。綜合考慮，確定水解時(shí)間為4 h 左右。

2.1.4 鹽酸濃度對(duì)水解的影響

在70 ℃下，料液比為2∶1(mg/mL)，鹽酸濃度分別為3、4、5、6、7、8 mol/L，甲醇∶鹽酸為4∶1，水解4 h，考察不同鹽酸濃度對(duì)水解得黃酮苷元含量的影響，結(jié)果見圖1(D)。由圖可得，隨鹽酸濃度的增加，苷元含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，原因可能為酸雖然可以使糖苷鍵質(zhì)子化，但是酸的濃度過高，可能會(huì)對(duì)黃酮的母核造成破壞，降低黃酮苷元的含量。綜合考慮，確定水解鹽酸濃度為6 mol/L 左右。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以水解溫度、水解時(shí)間和鹽酸濃度3 個(gè)指標(biāo)作為正交實(shí)驗(yàn)考察的優(yōu)化水平，每個(gè)因素選取3 個(gè)因素水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiments

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，極差分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)杜仲黃酮水解工藝的影響較大的因素依次為鹽酸濃度、水解時(shí)間和水解溫度。方差分析結(jié)果見表3，由方差分析可得，水解溫度和水解時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響達(dá)到顯著，而鹽酸濃度對(duì)黃酮苷元含量的影響達(dá)到極顯著。綜合考慮，確定最佳的水解工藝為A3B1C2，即水解溫度為80 ℃，水解時(shí)間為3 h，鹽酸濃度為6 mol/L。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

按照正交試驗(yàn)結(jié)果，在料液比為2∶1(mg/mL)條件下，將A3B1C2的工藝重復(fù)3 次，對(duì)該工藝的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，苷元的含量為2.512%(RSD=0.059%)，表明該工藝的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性較好，達(dá)到優(yōu)化目的。

杜仲葉中黃酮苷元主要為槲皮素和山奈酚，但是其游離存在的含量很低，經(jīng)測(cè)定槲皮素的含量為0.021%，而山奈酚為0.005%，本實(shí)驗(yàn)通過酸水解杜仲黃酮使水解物中的苷元含量達(dá)到2.512%，提高近100 倍。

2.3 杜仲黃酮苷元富集工藝的研究

采用不同梯度的甲醇-水體系以2 BV/h 的流速進(jìn)行洗脫，最后用100%甲醇洗至檢測(cè)不到苷元為止。洗脫液用薄層色譜跟蹤檢測(cè)，結(jié)果見表4。50%甲醇洗脫液中已經(jīng)含有苷元，含量極低，70%～100%洗脫液中苷元含量較高，合并洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得黃酮苷元粗品。HPLC 法測(cè)其純度為12.87%。

表4 薄層檢測(cè)洗脫液中苷元的結(jié)果Table 4 Enriching result of flavonoid aglycone in the eluent with TLC

將上述所得樣品干法上樣，進(jìn)行聚酰胺二次富集。洗脫流速為2 BV/h，每梯度洗脫體積為5 BV，經(jīng)水與低濃度的醇溶液除雜之后，用70%、90%和100%甲醇溶液洗脫，每50 mL 收集一次。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，50%甲醇洗脫液中并未檢測(cè)到杜仲黃酮苷元，黃酮苷元主要存在70%～100%洗脫液中，洗脫曲線如圖2 所示，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮，得杜仲黃酮苷元樣品。經(jīng)HPLC 法測(cè)定，黃酮苷元純度達(dá)63.19%，黃酮苷元純度較一步富集提升將近5 倍。

圖2 黃酮苷元的洗脫曲線Fig.2 The elution curve of flavonoid aglycone

3 結(jié)論

杜仲黃酮苷元可由酸水解制備所得，在料液比為2∶1(mg/mL)，水解溫度80 ℃，水解時(shí)間3 h，鹽酸濃度6 mol/L 的最佳工藝參數(shù)條件下，黃酮苷元最高含量可達(dá)2.512%;對(duì)水解液減壓濃縮、脫酸處理，經(jīng)聚酰胺一步富集，黃酮苷元含量為12.87%，所得樣品再干法上樣，經(jīng)聚酰胺兩步富集之后，杜仲黃酮苷元含量可達(dá)63.19%。

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