王 璟，盧 敏

(廣東佛山市山水區(qū)人民醫(yī)院眼科，廣東 佛山 528100)

蒺藜(Tribulus terrestris L)是一種中草藥植物，在我國民間用藥由來已久。研究表明蒺藜的提取物蒺藜總皂苷(gross saponin from Tribulus terrestris L，GSTT)具有有抑制血栓形成、抗血小板聚集、改善血液流變學(xué)、抗腦缺血及改善腦缺血部位的血流量、抗心肌缺血缺氧、減輕心腦缺血、缺氧損傷的作用［1，2］，臨床治療一般用于缺血性心腦血管疾病。本文旨在探討蒺藜總皂苷在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的作用，為臨床應(yīng)用提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年健康雄性SD 大鼠25 只，體質(zhì)量180～250g，清潔級，由武漢大學(xué)實驗動物中心提供。將入選動物分為對照組(Con)5 只、缺血再灌注組(IR)10 只和蒺藜總皂苷治療組(GSTT)10 只。

1.2 實驗方法 對照組不做特殊處理，IR組和GSTT組均以前房加壓法建立缺血再灌注模型［3］，并分別于缺血前24h 尾靜脈注射等量生理鹽水和蒺藜總皂苷(30mg/kg)。再灌注48h 后迅速處死動物，摘除眼球，顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜。

1.3 檢測方法

1.3.1 Western blot 法檢測cyclin D1 和CDK4 蛋白組織勻漿后提取蛋白，采用Bradford 法［4］測定蛋白含量。SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用0.2%TTBS 洗膜，5%脫脂奶粉封閉1h，加入1∶200兔多克隆cyclin D1 和CDK4 一抗(美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)于4℃下孵育過夜;用0.2%TTBS 洗膜，加入HRP 抗兔二抗于37℃下孵育1h;在暗室中采用化學(xué)發(fā)光法顯影，應(yīng)用Kodak 圖像分析系統(tǒng)處理免疫印跡條帶得出條帶光密度，結(jié)果以相對密度表示(相對密度=各組條帶平均光密度/對照組平均光密度)。

1.3.2 流式細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將組織剪碎后，用胰蛋白酶于37℃下消化，然后等量生理鹽水終止消化，經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾，離心，PBS ×2洗，細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1 ×106/ml，Annxin V/PI 雙標(biāo)檢測細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 cyclin D1 和CDK4 的表達(dá) 與對照組相比，缺血再灌注組cyclin D1(2.256 ±0.072)和CDK4(1.678 ±0.104)蛋白表達(dá)明顯升高(P ＜0.01);與缺血再灌注組比較，蒺藜總皂苷治療組cyclin D1(1.302 ±0.103)和CDK4(1.196 ±0.126)蛋白表達(dá)明顯降低(P ＜0.05 或0.01)，見表1、圖1。

表1 各組cyclin D1 和CDK4 蛋白相對密度及細(xì)胞凋亡率比較()

表1 各組cyclin D1 和CDK4 蛋白相對密度及細(xì)胞凋亡率比較()

與Con組相比，* P ＜0.01;與IR組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

圖1 視網(wǎng)膜缺血再灌注48h 后cyclin D1 和CDK4 蛋白表達(dá)

2.2 細(xì)胞凋亡情況 與對照組相比，缺血再灌注組細(xì)胞凋亡率(0.376 ±0.050)顯著升高(P ＜0.01)，蒺藜總皂苷治療后細(xì)胞凋亡率(0.229 ±0.045)明顯下降(P ＜0.05)，見表1，圖2。提示蒺藜總皂苷能夠抑制凋亡。

圖2 視網(wǎng)膜缺血再灌注48h 后細(xì)胞凋亡率

3 討論

青光眼、視網(wǎng)膜中央動脈栓塞等疾病均可導(dǎo)致缺血再灌注損傷的發(fā)生，損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是視覺功能損害的一個主要原因。近來研究表明有兩種不同的機(jī)制調(diào)控正常發(fā)育的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，一種是經(jīng)典的Caspase 通路，另一種涉及細(xì)胞周期蛋白［5］。細(xì)胞從G1 期進(jìn)入S 期的關(guān)鍵因子是細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)和細(xì)胞周期素依賴性激酶4(CDK4)。研究發(fā)現(xiàn)在大鼠局灶性腦缺血和全腦缺血后cyclin D1 和CDK4 表達(dá)明顯增加，1～2d 達(dá)到高峰，而凋亡高峰發(fā)生在缺血后2～3d［5，6］。應(yīng)用CDK 抑制劑可以抑制腦缺血后的神經(jīng)元凋亡［7］。神經(jīng)細(xì)胞是不能進(jìn)行增殖分裂的，cyclin D1 和CDK4 表達(dá)升高出現(xiàn)在缺血后的神經(jīng)細(xì)胞，作用可能是直接啟動了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而不是發(fā)揮其細(xì)胞周期中的作用。缺血后神經(jīng)保護(hù)作用的途徑之一有望通過對細(xì)胞周期蛋白進(jìn)行調(diào)控來實現(xiàn)。在本研究中，視網(wǎng)膜缺血再灌注后cyclin D1 和CDK4 蛋白表達(dá)升高，凋亡細(xì)胞增多，表明視網(wǎng)膜缺血再灌注后異常表達(dá)的cyclin D1 和CDK4 蛋白能夠促進(jìn)凋亡。

蒺藜總皂苷對心、腦缺血有較好的治療作用，對心、腦缺血引起的凋亡有明顯的抑制作用，其機(jī)制主要是抑制血栓形成、抗血小板聚集、改善血液流變學(xué)、抗腦缺血及改善腦缺血部位的血流量和抗心肌缺血缺氧。在本研究中，蒺藜總皂苷使視網(wǎng)膜缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡率下降，同時使cyclin D1、CDK4 蛋白表達(dá)降低，提示蒺藜總皂苷對cyclinD1 和CDK4 的調(diào)控作用可能是蒺藜總皂苷抑制視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷神經(jīng)元凋亡的機(jī)制之一。

［1］侯俊英，王秀華，李紅，等.蒺藜皂苷對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2004，20(4):418

［2］姜宗文，呂文偉，張志強(qiáng)，等.蒺藜果總皂苷對大鼠實驗性腦缺血的保護(hù)作用［J］.中草藥，2002，33(11):1020

［3］牛膺筠，張瑞，周占宇，等.堿性成纖維細(xì)胞生長因子對鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的治療作用［J］.中華眼科雜志，2012，38(9):530

［4］Li Y，Chopp M，Powers C，et al.Immunoreactivity of cyclin D1/cdk4 in neurons and oligodendrocytes after focal cerebral ischemia in rat［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1997，17(8):846

［5］Lossi L，Gambino G，Mioletti S，et al.In vivo analysis reveals different apoptotic pathways in pre-and postmigratory cerebellar granule cells of rabbit［J］.J Neurobiol，2004，60(4):437

［6］Timsit S，Rivera S，Ouaghi P，et al.Increased cyclin D1 in vulnerable neurons in the hippocampus after ischemia and epilepsy:a modulator of in vivo programmed cell death［J］.Eur J Neurosci，1999，11(1):263

［7］Osuga H，Osuga S，Wang F，et al.Cyclin-dependent kinases as a therapeutic target for stroke［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(18):10254