唐翠連，王芳，陳芳軍，張文斌

(1.湖南邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，湖南邵陽(yáng)422000;2.湖南邵陽(yáng)新寧縣人民醫(yī)院，湖南邵陽(yáng)422000; 3.湖南邵陽(yáng)武岡市人民醫(yī)院，湖南邵陽(yáng)422000;4.湖南邵陽(yáng)縣人民醫(yī)院，湖南邵陽(yáng)422000)

陰溝腸桿菌16S rRNA甲基化酶基因分布

唐翠連1，王芳2，陳芳軍3，張文斌4

(1.湖南邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，湖南邵陽(yáng)422000;2.湖南邵陽(yáng)新寧縣人民醫(yī)院，湖南邵陽(yáng)422000; 3.湖南邵陽(yáng)武岡市人民醫(yī)院，湖南邵陽(yáng)422000;4.湖南邵陽(yáng)縣人民醫(yī)院，湖南邵陽(yáng)422000)

目的了解湖南邵陽(yáng)地區(qū)耐氨基糖苷類抗菌藥物的陰溝腸桿菌中16S rRNA甲基化酶基因分布特點(diǎn)及其與氨基糖苷類抗菌藥物耐藥性的關(guān)系。方法收集2012年8月至2014年5月邵陽(yáng)地區(qū)新寧縣人民醫(yī)院、武崗市人民醫(yī)院、邵陽(yáng)縣人民醫(yī)院和邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院臨床樣本中分離的241株陰溝腸桿菌，采用API20E進(jìn)行菌種鑒定，同時(shí)用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行armA、npmA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD基因檢測(cè)，分析耐藥基因與耐藥表型的關(guān)系。結(jié)果241株陰溝腸桿菌中200株對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素和奈替米星4種氨基糖苷類抗菌藥物耐藥，其耐藥率分別為41.9%、68.5%、70.1%和63.5%。基因檢測(cè)結(jié)果提示，241株陰溝腸桿菌檢出2種16S rRNA甲基化酶基因，分別為armA(96株，39.8%)和rmtB(17株，7.1%)，未檢出npmA、rmtA、rmtC和rmtD基因。結(jié)論16S rRNA甲基化酶與氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性有相關(guān)性。不同地區(qū)分離的對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥的陰溝腸桿菌菌株攜帶16S rRNA甲基化酶的基因型有一定差異，湖南邵陽(yáng)地區(qū)陰溝腸桿菌以攜帶armA基因?yàn)橹鳌?/p>

陰溝腸桿菌;16S rRNA甲基化酶;耐藥性

陰溝腸桿菌是腸桿菌科中具有代表性的細(xì)菌之一，近年來(lái)在臨床其分離率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，僅次于大腸埃希菌，可從多種類型的標(biāo)本分離獲得，已經(jīng)成為本地區(qū)醫(yī)院感染的重要病原菌之一。氨基糖苷類藥物是具有氨基糖和氨基環(huán)醇結(jié)構(gòu)的一類抗菌藥物[1]，臨床上主要用于治療包括陰溝腸桿菌在內(nèi)的敏感革蘭陰性桿菌所引起的感染。由于該類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，臨床上分離出的耐氨基糖苷類抗菌藥物的陰溝腸桿菌陽(yáng)性率不斷增加，其主要原因?yàn)楫a(chǎn)氨基糖苷類修飾酶、細(xì)菌16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷類作用靶位16S rRNA基因突變及核糖體蛋白編碼基因突變[2]。本研究側(cè)重分析其他地區(qū)已有報(bào)道的armA、npmA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD 6種16S rRNA甲基化酶基因在陰溝腸桿菌中的分布。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

241株來(lái)自邵陽(yáng)地區(qū)新寧縣人民醫(yī)院、武崗市人民醫(yī)院、邵陽(yáng)縣人民醫(yī)院和邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院2012年8月至2014年5月臨床分離的非重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌(ATCC 25922)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)。

二、儀器與試劑

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀(英國(guó)HYBAID公司);GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。水解酪蛋白胨培養(yǎng)基、藥物敏感性紙片(英國(guó)OXOID公司);16S rRNA甲基化酶基因引物(上海生工生物工程技術(shù)有限公司);MasterMixPCR擴(kuò)增試劑(北京天根生化科技有限公司)。

三、細(xì)菌鑒定

采用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的API20E對(duì)241株細(xì)菌進(jìn)行再次鑒定。

四、體外藥物敏感性試驗(yàn)

運(yùn)用紙片擴(kuò)散法對(duì)慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素和奈替米星進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。

五、耐藥基因檢測(cè)

1.DNA提取采用蛋白酶K消化法制備DNA擴(kuò)增模板。

2.16S rRNA甲基化酶基因PCR擴(kuò)增16S rRNA甲基化酶基因引物序列參照文獻(xiàn)[3-4]設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括13 μL MIX、7 μL H2O、1 μL上游引物、1 μL下游引物、3 μL DNA模板。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。用英國(guó)HYBAID擴(kuò)增儀擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，SYBR Green染色，凝膠成像儀觀察結(jié)果并照相。

3.產(chǎn)物測(cè)序及分析對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性的16S rRNA甲基化酶基因PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生工生物工程技術(shù)有限公司應(yīng)用ABI 3700自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登陸網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 16S rRNA甲基化酶PCR擴(kuò)增引物序列

結(jié)果

一、藥物敏感性試驗(yàn)

241株陰溝腸桿菌中200株對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素和奈替米星4種氨基糖苷類抗菌藥物呈現(xiàn)1種或數(shù)種不等的耐藥，41株對(duì)4種氨基糖苷類抗菌藥物均敏感。對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、奈替米星4種氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥率分別為41.9%、68.5%、70.1%和63.5%，其中對(duì)阿米卡星的耐藥率最低。見表2。

表2 241株陰溝腸桿菌對(duì)4種氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性[例(%)]

二、耐藥基因檢測(cè)

241株陰溝腸桿菌中檢出2種16S rRNA甲基化酶基因，分別為armA(96株，39.8%)、rmtB (17株，7.1%)，其中有3株同時(shí)檢出2種基因型。這2種基因的檢出或缺失與菌株對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行一致性比較，結(jié)果見表3。圖1、圖2分別為部分菌株armA、rmtB基因PCR產(chǎn)物電泳圖。

表3 241株陰溝腸桿菌的16S rRNA甲基化酶耐藥基因與其對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥表型相關(guān)性比較

圖1 armA基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 rmtB基因PCR產(chǎn)物電泳圖

討論

國(guó)家的細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，陰溝腸桿菌的耐藥率逐年上升。深入了解陰溝腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制對(duì)于控制耐藥菌株的流行和播散及合理使用抗菌藥物具有重要意義。16S rRNA甲基化酶是細(xì)菌適應(yīng)生存環(huán)境的一種能力，它能將細(xì)菌細(xì)胞16S rRNA解碼區(qū)A位點(diǎn)上的特定核苷酸進(jìn)行甲基化處理，阻礙氨基糖苷類抗菌藥物結(jié)合到30S核糖體亞基上，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)該類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥[5]。曾有研究顯示該酶能在人和動(dòng)物之間播散[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)湖南邵陽(yáng)地區(qū)臨床分離的陰溝腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥性較強(qiáng)，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、奈替米星的耐藥率分別為41.9%、68.5%、70.1%和63.5%，應(yīng)引起臨床高度重視。

質(zhì)粒編碼的16S rRNA甲基化酶介導(dǎo)氨基糖苷類抗菌藥物耐藥，已經(jīng)在不同地區(qū)有所報(bào)道。浙江省臺(tái)州地區(qū)研究數(shù)據(jù)顯示16S rRNA甲基化酶基因型流行以rmtB為主[7]，昆明市延安醫(yī)院產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum betalactamases，ESBLs)革蘭陰性腸桿菌中16S rRNA甲基化酶基因的攜帶率約為10%[8]。而本次研究采用PCR對(duì)湖南邵陽(yáng)地區(qū)臨床分離的241株陰溝腸桿菌進(jìn)行16S rRNA甲基化酶基因檢測(cè)，檢出2種16S rRNA甲基化酶基因(armA、rmtB)，以armA(39.8%)耐藥基因介導(dǎo)為主。16S rRNA甲基化酶基因的攜帶對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性有較高的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(＞90%)，顯然這些耐藥基因的存在與該菌對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性密切相關(guān)。在本次調(diào)查中，多數(shù)菌株耐藥表型與基因型結(jié)果相一致，但也有個(gè)別菌株有差異，如有2株armA基因陽(yáng)性而表型為敏感，1株rmtB基因陽(yáng)性而表型為敏感，這有待于進(jìn)一步研究;104株表型耐藥而未檢出甲基化酶基因，我們分析可能存在其他的耐藥機(jī)制。相關(guān)研究顯示，不同地區(qū)分離的對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥的細(xì)菌16S rRNA甲基化酶基因型有一定的差異。本次調(diào)查在陰溝腸桿菌中發(fā)現(xiàn)armA基因?yàn)楸镜貐^(qū)的首次報(bào)道。

[1]孫艷，王沭，邵曉迪，等.頭孢拉宗與兩種氨基糖苷類抗菌藥物聯(lián)用對(duì)11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的聯(lián)合藥敏研究[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2013，10(2): 75-78.

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Distribution of 16S rRNA methylase gene of Enterobacter cloacae

TANG Cuilian1，WANG Fang2，CHEN Fangjun3，ZHANG Wenbin4.(1.The Affiliated Hospital of Shaoyang Medical College，Hunan Shaoyang 422000，China; 2.The People's Hospital of Xinning County，Hunan Shaoyang 422000，China;3.The People's Hospital of Wugang，Hunan Shaoyang 422000，China;4.The People's Hospital of Shaoyang County，Hunan Shaoyang 422000，China)

ObjectiveTo know the distribution characteristics of 16S rRNA methylase gene of Enterobacter cloacae being resistant to aminoglycoside antibiotics and the relationship between 16S rRNA methylase gene and aminoglycoside drug resistance in Shaoyang，Hunan.MethodsA total of 241 isolates of Enterobacter cloacae were collected from the Affiliated Hospital of Shaoyang Medical College，the People's Hospital of Xinning County，the People's Hospital of Wugang and the People's Hospital of Shaoyang County from August 2012 to May 2014，and were identified by API20E.The drug sensitivity test in vitro was performed by K-B method.The armA，npmA，rmtA，rmtB，rmtC and rmtD genes were determined by polymerase chain reaction(PCR).The relation between drug resistant gene and resistant phenotypes was analyzed.ResultsIn the 241 isolates of Enterobacter cloacae，200 isolotes of them were resistant to aminoglycoside antibiotics，including 41.9%isolates being resistant to amikacin，68.5%to gentamicin，70.1%to tobramycin，and 63.5%to netilmicin.Two kinds of 16S rRNA methylase genes were detected，among which were armA(96 isolates，39.8%)and rmtB(17 isolates，7.1%)，and no npmA，rmtA，rmtC and rmtD genes were detected.Conclusions16S rRNA methylase is closely related with the drug resistance of aminoglycoside antibiotics.Genotypes carried by 16S rRNA methylases are somewhat different in bacterial isolates from different areas，and armA is a main kind of 16S rRNA methylase gene in Shaoyang.

Enterobacter cloacae;16S rRNA methylase;Drug resistance

1673-8640(2015)07-0691-03

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.006

2014-07-07)

(本文編輯:姜敏)

湖南省教育廳科研項(xiàng)目(12C1219);湖南邵陽(yáng)市科技局科研項(xiàng)目(J1212)

唐翠連，女，1978年生，學(xué)士，副主任技師，主要從事微生物學(xué)檢驗(yàn)研究。