韓 嬌， 陽立波， 樊婷婷， 江海坤， 張其安， 方 凌， 任永兵， 馬文佳， 曹樹青*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,安徽合肥 230009)

一個(gè)抗旱/抗寒基因過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的篩選鑒定

韓 嬌1， 陽立波1， 樊婷婷1， 江海坤2， 張其安2， 方 凌2， 任永兵1， 馬文佳1， 曹樹青1*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,安徽合肥 230009)

[目的]進(jìn)一步研究LWT1基因在調(diào)控低溫和干旱應(yīng)答中的功能，構(gòu)建擬南芥LWT1基因過表達(dá)載體，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系。[方法]以野生型擬南芥的cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增LWT1基因全長(zhǎng)，將該基因連接到pART27載體上。將獲得的重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株GV3101，通過浸花轉(zhuǎn)化法將LWT1重組載體轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型植株中，利用轉(zhuǎn)基因篩選與遺傳鑒定獲得LWT1轉(zhuǎn)基因陽性植株。[結(jié)果]LWT1基因CDS全長(zhǎng)990 bp，PCR電泳結(jié)果一致，測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確。通過抗性篩選和分子鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植株。[結(jié)論]LWT1過表達(dá)載體構(gòu)建成功并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系，為進(jìn)一步研究該基因的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

擬南芥；LWT1基因；過表達(dá)；轉(zhuǎn)基因植株

由于植物自身的固著性，各種不良環(huán)境因素都會(huì)限制它們的生長(zhǎng)和發(fā)育,因此植物為自身的生長(zhǎng)發(fā)育采取一系列防御反應(yīng)來增加對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力[1]。植物面對(duì)缺水情況會(huì)通過一系列的生理分子過程來提高植物本身的耐受性[2]。通過分子和基因組分析許多干旱誘導(dǎo)基因已經(jīng)在擬南芥、水稻和其他植物中確定，其中包括一系列的調(diào)節(jié)脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量的轉(zhuǎn)錄因子[3]。最近在分析參與脅迫反應(yīng)的生化和生理途徑中有重大進(jìn)展，如一系列代謝反應(yīng)為了適應(yīng)干旱和高滲反應(yīng)而反生改變[4]。脅迫誘導(dǎo)基因不僅在最初脅迫反應(yīng)中起作用，而且還能增強(qiáng)植物的耐受能力[5]。低溫環(huán)境對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育具有不利影響，許多植物經(jīng)過冷馴化適應(yīng)了低溫環(huán)境，這主要是在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控可以使植物適應(yīng)低溫環(huán)境[6-7]。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是由CBF誘導(dǎo)ICE1的表達(dá)，在低溫適應(yīng)中CBF轉(zhuǎn)錄因子和非依賴CBF的調(diào)節(jié)子串聯(lián)在一起[8-9]。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)同樣能提高植物對(duì)低溫的耐受性。

合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在前期工作中篩選得到一個(gè)具有低溫和干旱敏感表型的突變體lwt1-1，有望通過LWT1基因的研究,揭示植物在低溫和干旱脅迫耐受過程中某些未知的調(diào)控機(jī)制。筆者通過構(gòu)建LWT1過表達(dá)材料，從而為該基因分子功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)材料。擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞野生型( Col-0 )，購買于美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心，由合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室繁衍保存。

1.1.2主要試劑。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA抽提試劑盒、TaqPCR酶、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ、高保真酶Phusion、T4DNA連接酶購于NEB公司,TIANGel MiDi Purification Kit、TIANquick MiDi Purification Kit、TIANprep MiniPlasmid kit購于天根公司維生素B5，Silwet L-77，蔗糖，MES，6--BA， KOH等。

1.1.3宿主菌和載體。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，農(nóng)桿菌感受態(tài)菌株GV3101，pART27載體(帶有35S強(qiáng)啟動(dòng)子)。

1.2 方法

1.2.1擬南芥植株的土培。①按照蛭石∶黑土∶珍珠巖=9.0∶3.0∶0.5的比例混均營(yíng)養(yǎng)土。將配制好的營(yíng)養(yǎng)液倒入托盤中，待營(yíng)養(yǎng)液被吸收完全后，即可播種擬南芥種子。②將待播種的擬南芥種子，按照需求均勻地點(diǎn)播在營(yíng)養(yǎng)土的表面。③待擬南芥植株長(zhǎng)大后，等培養(yǎng)盆中的水干透后再澆水。④待種子成熟后收種，放在30 ℃烘箱中干燥15 d后于-20 ℃保存。

1.2.2LWT1過表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.2.1LWT1基因的獲得。①利用軟件設(shè)計(jì)所需引物，LWT1過表達(dá)載體選用KpnⅠ和XhoⅠ 2個(gè)酶切位點(diǎn)。所需引物：FR: 5′CGGggtaccATGTTCGCGCGAAGAC，PR: 3′CGGctcgagCCGCTTCTTCGCTTTCCTTA。②以cDNA為模板，用Pusion高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2.2LWT1基因與載體的重組。①將回收的目的基因以及pART27質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ在37 ℃下進(jìn)行酶切。②用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接。③將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)中，用含有50 μg/ml壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。④挑取長(zhǎng)勢(shì)正常的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，陽性菌測(cè)序保存。

1.2.3浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌菌株，用含有50 μg/ml壯觀霉素和50 μg/ml慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，用轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染。

轉(zhuǎn)化方法：將農(nóng)桿菌搖菌至OD600=0.8左右，5 000 r/min離心10 min，離心所得菌體用滲透緩沖液重懸，至菌液稀釋到OD600為0.8左右。將待轉(zhuǎn)化的擬南芥花苞浸于滲透液中浸泡1～3 min，黑暗中放置12 h后放在正常環(huán)境中培養(yǎng)至收種。

1.2.4轉(zhuǎn)基因陽性株系的篩選鑒定。將待篩選種子撒到含有30 μg/ml潮霉素的1/2 MS平板上培養(yǎng)14 d，植株嫩綠能長(zhǎng)出真葉和根的作為T1代植株進(jìn)行移栽。

移栽的擬南芥植株培養(yǎng)28 d后，取擬南芥葉片用CTAB法提取基因組DNA。以DNA為模板擴(kuò)增LWT1基因，以此去除假陽性植株。將篩選的陽性植株所收獲的種子標(biāo)為T2。

用T1代所收種子(T2)再用潮霉素篩選鑒定分離比，選取潮霉素耐受(HygR)比對(duì)潮霉素敏感(HygS)的比例為3∶1的T2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增擬南芥LWT1基因?yàn)榱双@得LWT1基因，選取在MS培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)14 d的野生型擬南芥幼苗，提取擬南芥RNA，用RT Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板擴(kuò)增LWT1基因片段。結(jié)果見圖1a。由圖1a可知，LWT1目標(biāo)條帶大小與實(shí)際數(shù)據(jù)大小一致，說明成功獲得LWT1基因片段(990 bp)。同時(shí)提取pART27過表達(dá)菌株的質(zhì)粒，并進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1b。由圖1b可知，條帶大小正確，條帶清晰。

2.2 LWT1過表達(dá)載體的連接與轉(zhuǎn)化用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ切割目的基因和pART27載體，酶切后進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，酶切后的基因和載體條帶清晰、大小正確，可用于下一步試驗(yàn)。

將酶切過的基因和載體用連接酶于16 ℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用含有50 μg/ml Spec的LB平板篩選陽性單克隆。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并電泳檢測(cè)，LWT1過表達(dá)菌株的菌落PCR鑒定結(jié)果見圖3。由圖3可知，挑選的大部分單菌落都是陽性菌，擴(kuò)增后條帶大小也正確。

選取部分陽性菌進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)擬南芥網(wǎng)站上提供的LWT1基因的CDS序列與返回的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果為100%，說明LWT1過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定及篩選將所收種子撒到含有30 μg/ml潮霉素的1/2 MS平板上正常培養(yǎng)14 d。一般情況下，只有轉(zhuǎn)化成功的擬南芥植株才會(huì)有潮霉素抗性，生長(zhǎng)出正常的真葉與根。挑選生長(zhǎng)嫩綠和長(zhǎng)出根的幼苗進(jìn)行移栽?？剐院Y選結(jié)果見圖4。

移栽的植株培養(yǎng)到21 d左右時(shí)，剪取LWT1轉(zhuǎn)基因植株葉片提取DNA，在基因組水平上檢測(cè)LWT1基因的表達(dá)水平。選取LWT1過表達(dá)載體的上下游引物從基因組水平上鑒定，結(jié)果見圖5。由圖5可知，凡是轉(zhuǎn)化成功的擬南芥植株都成功擴(kuò)增了LWT1基因。這說明LWT1過表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型植株中。

選擇陽性苗單株收種子并標(biāo)記為T2代，用含有30 μg/ml潮霉素的1/2 MS平板篩選，選擇分離比為3∶1(單插入)的T2種子，選擇對(duì)應(yīng)單插入的陽性擬南芥植株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3 討論

干旱與低溫脅迫是植物抗逆研究的重點(diǎn),現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為這一領(lǐng)域的研究注入了新的活力。目前同時(shí)具有抗寒和抗旱功能的基因甚少,而發(fā)現(xiàn)的LWT1基因同時(shí)具有抗寒與抗旱的功能。研究其抗寒與抗旱機(jī)制,對(duì)于農(nóng)林業(yè)的抗寒與抗旱育種研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。隨著一些抗逆基因的鑒定和抗逆機(jī)理不斷深入研究，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源抗逆基因?qū)胫参锘蚪M，該技術(shù)在提高植物抗逆性、改良作物遺傳性狀及培育農(nóng)作物優(yōu)良品系等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[10-11]。

該試驗(yàn)通過遺傳學(xué)方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因過表達(dá)材料，可以用于研究LWT1基因在干旱和低溫脅迫調(diào)控過程中的生化和分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究該基因的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Construction and Characterization of a Drought / Cold Tolerant Gene Overexpression Lines inArabidopsis

HAN Jiao, YANG Li-bo, FAN Ting-ting, CAO Shu-qing*et al

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009)

[Objective] In order to further confirm thatLWT1 gene is involved in the regulation of low temperature and drought stress responses, the transgenic lines ofLWT1 overexpression were generated. [Method] The full-lengthLWT1 coding sequence was amplified through PCR from cDNA ofArabidopsisthaliana(Col-0) using specific primers and cloned into the pART27 vector. The resulting construct was transformed intoAgrobacteriumstrainGV3101 for transformation into the Col-0 plants by the floral dip method. The transgenic lines were isolated through antibiotic screening and genetic identification. [Result] The PCR product is 990 bp which is the same as the full-lengthLWT1 CDS. The transgenic plants is gained and verified by genetic identification. [Conclusion] The vector was constructed successfully, and transgenic plants were obtained. The study will lay a foundation for further study.

Arabidopsis;LWT1 gene; Overexpression; Transgenetic lines

安徽省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(1308085QC56)；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(1201a0301009)。

韓嬌(1989- )，女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：分子基因調(diào)控。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事植物抗逆基因克隆及應(yīng)用研究。

2015-03-25

S 188

A

0517-6611(2015)13-048-03