繆菊連， 黃照昌， 王成軍， 楊永壽

(1. 大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理671000;2. 大理藥業(yè)，云南 大理671000)

生脈飲原名“生脈散”，出自金元時(shí)代名醫(yī)李東垣所著的《內(nèi)外傷辨惑論》，由紅參100 g、麥冬200 g、五味子100 g 組成，為《中國(guó)藥典》2010 年版一部“成方制劑和單味制劑”項(xiàng)下收載品種［1］，有益氣生津、斂陰止汗之功效［2］，用于治療氣陰兩虛、心悸氣短、脈微自汗，氣血兩虛型脫發(fā)、失眠等癥［3-4］?！吨袊?guó)藥典》2010 年版項(xiàng)下對(duì)生脈飲質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是采用人參二醇、人參三醇和麥冬對(duì)照藥材為對(duì)照，對(duì)紅參、麥冬進(jìn)行了TLC 鑒別，無成分定量測(cè)定項(xiàng)。2011 年10 月國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)頒布的批件號(hào)為ZGB201-20 生脈飲藥品標(biāo)準(zhǔn)中，只在《中國(guó)藥典》2010 年版的基礎(chǔ)上增加五味子藥材TLC 鑒別和五味子醇甲定量測(cè)定項(xiàng)目。從文獻(xiàn)資料報(bào)道來看，主要增加了五味子乙素、五味子醇甲和人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的HPLC 測(cè)定［5-10］。麥冬皂苷［11］具有抗心肌缺血、抗心肌梗阻、抗心律失常的作用，影響心肌的生理特性，而在麥冬皂苷中又以麥冬皂苷D 為主。如能對(duì)生脈飲中的麥冬皂苷進(jìn)行測(cè)定，將有助于更全面的評(píng)價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-ELSD 測(cè)定麥冬皂苷D 的方法，對(duì)全面評(píng)價(jià)生脈飲的質(zhì)量提供一定的依據(jù)。

1 儀器與試劑

1260 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司);2000ES ELSD 檢測(cè)器(美國(guó)奧泰公司);色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5.0 μm)，BP2250 電 子 天 平 (Sartorius 公 司)，Cleanert ODS C18小柱(天津博納艾杰爾科技有限公司);麥冬皂苷D 對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司提供，批號(hào)SM0521KA13，純度98.2%);乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，純化水(自制);生脈飲自制(批號(hào)分別為130501，130502，130503)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取麥冬皂苷D 對(duì)照品2.02 mg 置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻即得，質(zhì)量濃度為404 μg/mL。

2.2 供試品溶液的制備 取紅參100 g，麥冬200 g，五味子100 g 粗粉，用65%乙醇浸漬24 h 后滲漉，收集滲漉液4 500 mL，減壓濃縮至250 mL，放冷，加水400 mL 稀釋，濾過，另加60%糖漿300 mL，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.5，加水至1 000 mL，精密量取20 mL 置于分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取4 次，每次30 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)? mL 水溶解，上處理好的ODS小柱，控制上樣和洗脫過程體積流量為0.7 mL/min，先用20 mL 水沖洗，再用55%甲醇水溶液20 mL 沖洗，最后用65%甲醇水溶液30 mL 沖洗，收集65%甲醇水溶液，水浴蒸干，殘?jiān)眉状嫁D(zhuǎn)移至2 mL 量瓶中，定容至刻度，搖勻即得。

2.3 陰性樣品溶液的制備 按“2.2”項(xiàng)制備方法制得不含麥冬的陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件 UItimate XB-C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，體積流量2.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，ELSD檢測(cè)器，氣體體積流量2.5 L/min，漂移管溫度95 ℃;流動(dòng)相為乙腈-水(52 ∶48)，進(jìn)樣量為20 μL，結(jié)果見圖1、2、3。

圖1 麥冬皂苷D 對(duì)照品HPLC 圖

圖2 供試品

圖3 陰性供試品

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 配制對(duì)照品系列溶液，使麥冬皂苷D 質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80 μg/mL，依次進(jìn)樣20 μL，按上述色譜條件依法測(cè)量它們的峰面積，以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)(logC)為橫坐標(biāo)X，以峰面積的對(duì)數(shù)(logA)為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸，得線性方程為:Y =1.024 9X+0.996 8，r=0.999 7，線性范圍5 ～80 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的對(duì)照品溶液6 份，分別精密吸取20 μL 注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算，結(jié) 果 分 別 為10.05、10.22、10.22、10.01、9.82、10.18 μg/mL，平均為10.08 μg/mL，RSD 為1.6%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)130501)按要求制得的供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h 精密吸取20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果為10.05、10.03、9.82、10.15、9.96、10.24 μg/mL，平均為10.04 μg/mL，RSD 為1.5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批次的生脈飲(130501)樣品6 份，在上述色譜條件下分別進(jìn)行HPLC 分析，計(jì)算麥冬皂苷D 的量，RSD 為1.3%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為404 μg/mL)40、50、60 μL 各3 份，每份精密加入生脈飲10 mL，置于分液漏斗中，按“2.2”項(xiàng)進(jìn)行樣品處理，依法測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定 精密量取3 個(gè)批號(hào)(130501、130502、130503)的生脈飲，配制成供試品溶液，在上述色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μL、20 μL 與供試品20 μL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算麥冬皂苷D 的量，結(jié)果分別為(10.18 ±0.072)μg/mL、 (10.60 ±0.090)μg/mL、(10.43±0.046)μg/mL。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品的前處理方法進(jìn)行了研究，比較了直接蒸干用甲醇定容、高速離心、正丁醇-水液液萃取、固相小柱萃取及大孔吸附樹脂除雜5 種方法對(duì)樣品中雜質(zhì)的除去及麥冬皂苷D 的影響，結(jié)果表明，各種前處理方法均不能充分去除雜質(zhì)，對(duì)麥冬皂苷D 的測(cè)定影響較大。而采用正丁醇-水液液萃取結(jié)合固相小柱萃取的方法，在除去雜質(zhì)的同時(shí)能將正丁醇部位所含成分全部洗脫下來。實(shí)驗(yàn)中用中藥材按相同比例制備了紅參-五味子(缺麥冬)的樣品溶液，按本方法分析，結(jié)果顯示待測(cè)定的組分均不存在明顯干擾，見圖3。Chang［12］等采用HPLC-MS 對(duì)生脈散中活性成分進(jìn)行分析，檢測(cè)到生脈散中麥冬活性成分之一麥冬甲基黃烷酮B。王艷慧等［13］采用HPLC-DAD-MS/MS 對(duì)不同來源生脈產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)，Zhang 等［14］采用HPLC-MS-MS 對(duì)參麥注射液進(jìn)行分析，麥冬作為產(chǎn)品不可或缺的組成藥味，在產(chǎn)品中并沒有檢出麥冬的成分，可能原因，一是麥冬藥材中麥冬皂苷D 的平均含有量約為0.03%［15］，量很低，加之生產(chǎn)過程的損失，導(dǎo)致產(chǎn)品中含有量不高;二是人參、五味子藥材的存在對(duì)麥冬皂苷D 的檢測(cè)干擾較大，需進(jìn)行較為徹底的前處理。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:653.

［2］ 梁曉艷，梁旭霞，朱杰民. HPLC 測(cè)定生脈飲中五味子甲素和五味子乙素的含量［J］. 廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，13(3):48-49.

［3］ 曹 雯，許道龍，范新建，等. 用HPLC-ELSD 法分析生脈飲中人參皂苷Re 的含量［J］. 藥學(xué)服務(wù)與研究，2010，10(3):228-229.

［4］ 王樹業(yè)，賈彩肖，許云肖. 生脈飲治療氣血兩虛型脫發(fā)、失眠的療效觀察［J］. 臨床合理用藥，2011，4(8B):58.

［5］ 黃海欣. ELSD-HPLC 法測(cè)定生脈飲中人參皂苷Re、Rgl和Rbl的含量［J］. 中國(guó)藥師，2010，13(7):1044-1045.

［6］ 劉鳳蘭，李東升. HPLC 法測(cè)定生脈飲中五味子醇甲的含量［J］. 黑龍江醫(yī)藥，2008，21(4):16-17.

［7］ 錢 梅. 生脈飲中五味子乙素和人參皂苷的鑒定分析與質(zhì)量控制［J］. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24(6):1422-1423.

［8］ 馮雪松，王大成，劉雅茹. 高效液相色譜法測(cè)定生脈飲中6 種活性成分的含量［J］. 化學(xué)與生物工程，2008，25(2):76-78.

［9］ 文惠玲，李曼莎. 生脈飲超微提取液中人參成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］. 中藥材，2009，32(8):1309-1311.

［10］ 潘曉麗，董小萍，駱驕陽，等. HPLC 同時(shí)測(cè)定生脈飲中人參皂苷Rb1、Rg1 的含量［J］. 中藥與臨床，2010，1(1):28-30.

［11］ 陽美平，吳 皓，尹 蓮，等. 麥冬皂苷和多糖類成分的研究進(jìn)展［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26 (10):2169-2171.

［12］ Chang Y W，Yao H T，Chien D S，et al. High-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry for the simultaneous determination of multiple active components in Sheng-Mai San，a prescription of traditional Chinese medicine［J］.Phytochem Anal，2008，19(3):258-265.

［13］ 王艷慧，朱丹妮. 基于HPLC-DAD-MS/MS 的不同來源生脈產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)［J］. 中國(guó)科技論文，2012，7(3):230-235.

［14］ Zhang Haijiang，Wu Yongjiang，Cheng Yiyu. Analysis of‘SHENMAI’injection by HPLC/MS/MS［J］. J Pharm Biomed Anal，2003，31(1):175-183.

［15］ 俞建平，馬月光，邵建峰，等. ELSD-HPLC 法測(cè)定浙麥冬、川麥冬中麥冬皂苷D 含量的方法研究［J］. 中藥新藥與臨床藥理，2002，13(4):253-255.