李 麗， 王林萍

(淄博市中心醫(yī)院干?？?，山東 淄博255036)

雞血藤CauLis spatholobi 為豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn 的干燥藤莖，是一味傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，本草論著中記載，它具有去瘀血、生新血之功效，為“血分之圣藥”，主要含有黃酮類、酚類和三萜類等化合物［1］。雞血藤總黃酮為雞血藤的醇提物，具有抗腫瘤［2］活性，并且對腦缺血［3］和肝損傷有保護作用［4］。目前，關(guān)于雞血藤總黃酮對心肌缺血的研究尚無報道。本實驗擬采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法，用于觀察其對大鼠急性心肌缺血的保護作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑 雞血藤總黃酮(濱州醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心)，提取方法為稱取雞血藤適量，烘干，粉碎，95%乙醇超聲提取2.5 h，抽濾，重復2 次，合并濾液，減壓回收乙醇，得到雞血藤提取物，以蘆丁為對照品，測得其中總黃酮的含有量≥80%;單硝酸異山梨酯片(齊魯制藥有限公司);烏拉坦(天津基準化學試劑有限公司);谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(北京中生北控生物科技股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗儀器 FX-2111 單道心電圖機(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司);DL-4000B 冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠);AUTOLAB 全自動生化分析儀 (意大利AMS公司)。

1.3 實驗動物 清潔級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量200 ～250 g (北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格號SYXK［魯］20060009)。

2 方法

2.1 動物分組、給藥及模型的復制 參考文獻［5］，取心電圖檢測合格的大鼠60 只，隨即分為假手術(shù)組、模型組、單硝酸異山梨酯(10 mg/kg)組、雞血藤總黃酮(20、40 和80 mg/kg)劑量組。其中，給藥組每天灌胃給藥(10 mL/kg)1 次，連續(xù)7 d，而假手術(shù)組和模型組灌胃給予等體積的去離子水。于末次給藥后1 h，20% 烏拉坦(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉，仰位固定于手術(shù)臺上，記錄正常標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖，沿胸骨左緣3 ～4 肋間開胸，暴露心臟，于距左心耳下緣2 mm 水平處，結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支(假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎)，結(jié)扎后即刻擠出胸腔氣體，關(guān)閉胸腔，迅速縫合胸壁。

2.2 心電圖ST 段的測定 于冠脈結(jié)扎前所記錄的心電圖作為缺血前值(基礎(chǔ)值)，結(jié)扎后于30、60、90、120 和180 min 分別記錄心電圖，測量并計算ST 段抬高幅度。

2.3 心肌組織中SOD 活性及MDA 水平的測定 實驗結(jié)束后，分離心肌組織，以4 ℃生理鹽水沖洗表面的血液殘留，冰浴下制成10%組織勻漿液，離心，取上清液，按照考馬斯亮蘭試劑盒操作說明測定蛋白、心肌組織中SOD 活性及MDA 的水平。

2.4 血清中GOT、CK 和LDH 水平的測定 于術(shù)后180 min 腹主動脈取血，離心取血清，測定GOT、CK 和LDH的水平。

2.5 心肌組織病理形態(tài)學觀察 取左心室缺血區(qū)心肌組織，中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色，光學顯微鏡下觀察［6］。

3 結(jié)果

3.1 雞血藤總黃酮對心肌缺血大鼠心電圖ST 段的影響 模型組ST 段抬高幅度顯著高于假手術(shù)組(P ＜0.01)，表明大鼠急性心肌缺血模型復制成功。與模型組相比，雞血藤總黃酮40 和80 mg/kg 劑量組ST 段抬高幅度顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，具有統(tǒng)計學意義，而20 mg/kg 劑量組不明顯(P ＞0.05)。單硝酸異山梨酯組ST 段抬高幅度與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，見表1。

表1 雞血藤總黃酮對左冠狀動脈前降支結(jié)扎大鼠ST 段的影響(±s)

表1 雞血藤總黃酮對左冠狀動脈前降支結(jié)扎大鼠ST 段的影響(±s)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) 基礎(chǔ)值/mV 30 min/mV 60 min/mV 90 min /mV 120 min/mV 180 min/mV假手術(shù)組 — 0.06 ±0.02 0.07 ±0.02 0.08 ±0.02 0.06 ±0.02 0.07 ±0.02 0.06 ±0.02模型組 — 0.07 ±0.02 0.46 ±0.09＊＊ 0.45 ±0.07＊＊ 0.45 ±0.06＊＊ 0.39 ±0.07＊＊ 0.37 ±0.07＊＊單硝酸異山梨酯 10 0.06 ±0.01 0.32 ±0.09△△ 0.34 ±0.06△ 0.35 ±0.05△ 0.33 ±0.08△ 0.30 ±0.05△雞血藤總黃酮 80 0.06 ±0.02 0.34 ±0.06△ 0.32 ±0.08△△ 0.32 ±0.07△△ 0.32 ±0.05△△ 0.29 ±0.06△△雞血藤總黃酮 40 0.08 ±0.02 0.35 ±0.08△ 0.35 ±0.07△ 0.36 ±0.06△ 0.34 ±0.06△ 0.31 ±0.06△雞血藤總黃酮 20 0.07 ±0.01 0.43 ±0.09 0.44 ±0.09 0.43 ±0.07 0.42 ±0.07 0.36 ±0.08

3.2 雞血藤總黃酮對心肌組織中SOD 活性和MDA 水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD 活性顯著降低(P ＜0.01)，而MDA 水平顯著升高(P ＜0.01)，說明急性心肌缺血導致組織的抗氧化能力顯著降低。雞血藤總黃酮40 和80 mg/kg 劑量組大鼠心肌組織中SOD 活性顯著高于模型組，而MDA 水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01);與模型組相比，單硝酸異山梨酯組SOD 亦升高，并降低MDA，具有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.01)，見表2。

3.3 雞血藤總黃酮對血清GOT、CK 和LDH 水平的影響模型組血清LDH、CK 和GOT 水平顯著高于假手術(shù)組(P ＜0.01)，表明大鼠急性心肌缺血模型復制成功。與模型組相比，雞血藤總黃酮40 和80 mg/kg 劑量組三者水平顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，而20 mg/kg 劑量組不明顯(P ＞0.05)。單硝酸異山梨酯組三者水平較模型組顯著降低，具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)，見表3。

表2 雞血藤總黃酮對冠脈結(jié)扎大鼠心肌中SOD 活性和MDA 水平的影響(±s，n=10)

表2 雞血藤總黃酮對冠脈結(jié)扎大鼠心肌中SOD 活性和MDA 水平的影響(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1)SOD/(U·mg protein -1)MDA/(mmol·mg protein -1)4.83 ±1.72 7.35 ±1.41模型組 — 1.75 ±0.68＊＊ 13.42 ±1.79＊＊單硝酸異山梨酯 10 3.16 ±0.83△△ 10.63 ±2.32△△雞血藤總黃酮 80 3.34 ±0.87△△ 10.96 ±1.82△△雞血藤總黃酮 40 2.79 ±0.74△ 11.26 ±1.74△雞血藤總黃酮假手術(shù)組 —20 2.37 ±0.65 12.03 ±1.97

表3 雞血藤總黃酮對冠脈結(jié)扎大鼠血清GOT、CK 和LDH 的影響(±s，n=10)

表3 雞血藤總黃酮對冠脈結(jié)扎大鼠血清GOT、CK 和LDH 的影響(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) GOT/(U·L -1) CK/(U·L -1) LDH/(U·mL -1)58.75 ±6.87 713.84 ±153.26 434.15 ±108.26模型組 — 438.47 ±97.26＊＊ 3 984.27 ±1 143.55＊＊ 3 548.65 ±1 084.42＊＊單硝酸異山梨酯 10 274.47 ±90.51△△ 2 537.14 ±837.46△△ 1 792.13 ±607.36△△雞血藤總黃酮 80 254.62 ±73.24△△ 2 215.47 ±613.22△△ 1 759.37 ±528.82△△雞血藤總黃酮 40 291.47 ±71.83△ 2 791.36 ±988.76△ 2 107.53 ±827.26△雞血藤總黃酮 20 351.34 ±112.43 3 369.07 ±972.43 2 851.18 ±91假手術(shù)組 —4.22

3.4 雞血藤總黃酮對心肌組織病理學的影響 光學顯微鏡下可見，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，心肌間質(zhì)未見炎癥細胞浸潤;模型組心肌纖維腫脹，排列紊亂，心肌間質(zhì)中出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，甚至可見局灶性壞死區(qū);雞血藤總黃酮40 和80 mg/kg 劑量組心肌組織細胞核大小較均勻，心肌纖維排列較整齊，呈輕度腫脹，偶見炎癥細胞浸潤;單硝酸異山梨酯組HE 病理表現(xiàn)與雞血藤總黃酮40 mg/kg劑量組相似，見圖1。

4 討論

冠心病(缺血性心臟病)屬于中醫(yī)“胸痹”范疇，主要病機是氣滯、血瘀、寒凝、痰阻導致胸陽不振，心脈痹阻。誘導大鼠急性心肌缺血的方法很多，其中結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支與冠心病人嚴重心肌缺血及心肌梗死時的血流動力學和心肌代謝等指標的改變有一定相似之處，而且梗死發(fā)生快，缺血范圍較固定，模型可靠。雞血藤是一味傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，而黃酮類是其主要成分之一，目前尚未報道雞血藤總黃酮對心肌缺血保護作用的相關(guān)研究。因此，本實驗采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法復制心肌缺血模型，從心肌中SOD 和MDA、血清心肌酶(GOT、CK 和LDH)水平及組織形態(tài)等方面來探討雞血藤總黃酮對大鼠急性心肌梗死的保護作用及機制。實驗結(jié)果表明，它能顯著抑制結(jié)扎冠狀動脈前降支致心肌缺血大鼠心電圖ST 段抬高、升高心肌SOD 活性、降低MDA 水平和心肌酶活性，而且還可顯著減輕心肌組織的病理改變。

圖1 雞血藤總黃酮對心肌病理組織學的影響(HE，×200)

心電圖ST 段的改變是心肌缺血最早期出現(xiàn)的、最敏感確切的指標之一，是反映心肌缺血性損傷范圍和程度的可靠指標［7］。本實驗發(fā)現(xiàn)，雞血藤總黃酮可劑量依賴性地抑制冠脈結(jié)扎所致大鼠心電圖ST 段的抬高，表明它對冠脈結(jié)扎所致大鼠心肌缺血具有一定的保護作用。

大量氧自由基的形成是心肌缺血發(fā)生的主要機制之一［8］，而氧自由基和脂質(zhì)過氧化反應在機體的新陳代謝過程中起著重要作用。在正常情況下，這兩者處于協(xié)調(diào)與動態(tài)平衡狀態(tài)，維持著體內(nèi)許多生理生化和免疫反應，一旦這種平衡狀態(tài)被打破，機體就會處于一種氧化應激狀態(tài)，在心肌缺血損傷的發(fā)生和發(fā)展過程中起著十分重要的作用。當心肌缺血時，氧自由基大量產(chǎn)生，與細胞膜上的多聚不飽和脂肪酸反應，發(fā)生脂質(zhì)過氧化。同時，由于要清除體內(nèi)過量的氧自由基，從而導致組織的抗氧化能力下降。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 對細胞膜有很強的破壞作用，使膜流動性和通透性發(fā)生變化，細胞內(nèi)外離子分布異常，進而抑制心肌功能，最終導致心肌細胞從可逆性損傷發(fā)展為細胞死亡。心肌酶GOT、CK 和LDH 廣泛存在于心肌組織，當心肌缺血時，心肌細胞受到損傷，大量心肌酶釋放入血，故測定血清中心肌酶活性可反映心肌細胞的損傷程度［9］。SOD 是內(nèi)源性氧自由基清除劑，而MDA 是脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物，兩者均是反映氧自由基產(chǎn)生及引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應程度的指標。測定MDA 水平和SOD 活性能反映出心肌遭氧自由基攻擊的程度［10-11］和體內(nèi)清除氧自由基的能力［12-13］。實驗結(jié)果表明，雞血藤總黃酮中、高劑量組可明顯抑制冠脈結(jié)扎致大鼠心肌組織SOD 活性的降低和MDA水平的升高，顯著抑制心肌酶(GOT、CK 和LDH)活性的增加，提示其可能通過提高內(nèi)源性抗氧化酶SOD 活性，清除氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應，減輕對心肌細胞的損傷，從而起到保護心肌損傷的作用。

另外，心臟病理組織學檢查結(jié)果表明，雞血藤總黃酮能顯著減輕心肌纖維腫脹、炎癥細胞浸潤以及局灶性壞死的程度。

綜上所述，雞血藤總黃酮對左冠狀動脈前降支結(jié)扎所致大鼠心肌缺血損傷具有一定保護作用，其機制可能與清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

［1］ 崔艷君，劉 屏，陳若蕓. 雞血藤的化學成分研究［J］. 藥學學報，2002，37(10):784-787.

［2］ 唐 勇，何 薇，王玉芝，等. 雞血藤總黃酮類組分抗腫瘤活性研究［J］. 中國實驗方劑學雜志，2007，13(2):51-54.

［3］ 徐愛鈺，陳從顯，許 勇，等. 雞血藤總黃酮對大鼠腦缺血的保護作用及機制研究［J］. 濱州醫(yī)學院學報，2012，35(5):338-341.

［4］ 陳從顯，徐愛鈺，許 勇，等. 雞血藤總黃酮對小鼠急性肝損傷的保護作用［J］. 濱州醫(yī)學院學報，2012，35(3):188-191.

［5］ 孫 立，龍子江，張道福，等. 無患子皂苷對大鼠心肌缺血的保護作用［J］. 中國實驗方劑學雜志，2011，17(1):110-112.

［6］ 李 偉，王旭東，葛海燕，等. 復心煎抗大鼠心肌缺血再灌注損傷機制研究［J］. 中國實驗方劑學雜志，2011，17(13):170-173.

［7］ Kelbaek H，Terkelsen C J，Helqvist S，et al. Randomized comparison of distal protection versus conventional treatment in primary percutaneous coronary intervention:the drug elution and distal protection in ST-elevation myocardial infarction (DEDICATION)trial［J］. J Am Coll Cardiol，2008，51 (9):899-905.

［8］ Valko M，Leibfritz D，Moncol J，et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］. Int J Biochem Cell Biol，2007，39(1):44-84.

［9］ 許波華，許 立. 中藥抗心肌缺血作用機制的研究進展［J］. 中國實驗方劑學雜志，2011，17(15):265-269.

［10］ Basu S. Carbon tetrachloride-induced lipid peroxidation:eicosanoid formation and their regulation by antioxidant nutrients［J］. Toxicology，2003，189(1/2):113-127.

［11］ Fattman C L，Schaefer L M，Oury T D. Extracellular superoxide dismutase in biology and medicine［J］. Free Radic Biol Med，2003，35(3):236-256.

［12］ Nakamura T，Kuroda Y，Yamashita S，et al. Edaravone attenuates brain edema and neurologic deficits in a rat model of acute intracerebral hemorrhage［J］. Stroke，2008，39(2):463-469.

［13］ Afonso V，Champy R，Mitrovic D，et al. Reactive oxygen species and superoxide dismutases:role in joint diseases［J］. Joint Bone Spine，2007，74(4):324-329.