張廣唱， 郭殷銳， 王 劍， 武哲麗*

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣東省中醫(yī)治法與中藥創(chuàng)制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006;2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006)

降血壓水包油微乳巴布劑是由吳茱萸和川芎兩味藥組成，對(duì)高血壓、心絞痛等疾病的治療具有顯著效果。吳茱萸Evodia rutaecarpa 具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉之功效。外用貼于涌泉穴具有引火下行作用，臨床常用于治療高血壓、頭痛等疾?。?］。吳茱萸堿(evodiamine，EVO)和吳茱萸次堿(rutaecarpine，RUT)是其主要的有效活性成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有降壓、強(qiáng)心、抗心律失常、抗血栓等作用［2-3］。川芎具有行氣活血，祛風(fēng)止痛功效，臨床上廣泛用于頭痛、冠心病、高血壓等，其所含有效成分為川芎嗪和阿魏酸等［4］。

微 乳 (microemulsion，ME) 也 稱 納 米 乳(nanoemulsion)是粒徑為10 ～100 nm，由水、油、表面活性劑和助表面活性劑組成的一種流動(dòng)、透明、熱力學(xué)穩(wěn)定、均質(zhì)性的液體。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可增加難溶性藥物的溶解度、延長(zhǎng)作用時(shí)間、口服或外用均可提高生物利用度［5-6］，表面活性劑HLB值在8 ～18 可以形成O/W 型微乳。巴布劑(cataplasm)系指將藥物加入水溶性高分子化合物作為基質(zhì)所制成的貼膏劑。相對(duì)于其他外用貼膏，巴布劑具有載藥量大，透氣性、保濕性好，刺激性小，應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)［7］。由于吳茱萸中有效成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿為脂溶性，難溶于水，而巴布劑基質(zhì)主要由水溶性基質(zhì)組成，脂溶性成分難于通過水溶性基質(zhì)進(jìn)入皮下發(fā)揮藥效。而采用O/W 微乳技術(shù)，可有效提高脂溶性有效成分的經(jīng)皮透過率。本實(shí)驗(yàn)在確定降血壓水包油微乳的最佳處方及用量基礎(chǔ)上，以初黏力、內(nèi)聚力、皮膚追隨性、外觀性狀和反復(fù)揭貼性為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選降壓水包油微乳巴布劑基質(zhì)配比。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HH-50L 循環(huán)水反應(yīng)釜(開封市宏興科教儀器廠);RE-3005 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司);YB-P6 型智能透皮儀(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AUI220 分析天平(廣州湘儀機(jī)電設(shè)備有限公司);LC-20A 高效液相色譜儀(島津，日本);QYYS-20A 超純水機(jī)(重慶前沿水處理設(shè)備有限公司);LY-105N 型管式離心機(jī)(遼陽陽光制藥機(jī)械有限公司);SS 型三足式離心機(jī)(張家港市潤(rùn)星機(jī)械廠);FY-6032 初黏性測(cè)試儀(深圳市方源儀器有限公司);WN801 激光粒度分析儀(濟(jì)南微納儀器有限公司);8S-1 磁力攪拌器(常州普天儀器制造有限公司)。

1.2 試藥 冰片(阿拉丁，批號(hào)11182);明膠(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20140810);卡波姆(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20140116);酒石酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20140305);甘油(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20140312);Viseomate-NP800 (天津市福晨化學(xué)試劑廠);甘羥鋁(天津市富于精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20140215)。乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20140512);乙腈(色譜純，Dikma，批號(hào)608001003);四氫呋喃(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20140206);冰醋酸(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20140208);肉豆蔻酸異丙酯(阿拉丁，批號(hào)110270);吐溫-80 (天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20140316);CO-40 氫化蓖麻油(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20140309);氯化鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20131009)。吳茱萸(廣州南北行中藥飲片有限公司，批號(hào)20140503G322);川芎(廣州南北行中藥飲片有限公司，批號(hào)20140506G106)。

2 方法與結(jié)果

2.1 川芎、吳茱萸有效部位的提取及分離

2.1.1 吳茱萸提取分離［8］將4.5 kg 吳茱萸置烘箱干燥24 h，再置于循環(huán)水反應(yīng)釜中，加入10 倍量70%乙醇，80 ℃加熱回流2 h，提取3 次，將提取液濃縮至含生藥量1 g/mL，放置于4 ℃冰箱10 d，將濃縮液離心，離心藥液減壓濃縮。所得濃縮液經(jīng)D101 大孔樹脂純化，棄3 BV 純水與20%乙醇洗脫液，收集70%乙醇洗脫液，濃縮至浸膏狀，浸膏經(jīng)乙酸乙酯萃取3 次，乙酸乙酯萃取部位揮去有機(jī)溶劑，冷藏備用。

2.1.2 川芎提取分離［9］將10 kg 川芎置烘箱干燥24 h，加入足量70%乙醇滲漉，至浸出液顏色近無色為止，離心，收集上清液減壓濃縮至浸膏狀。加入少量蒸餾水溶解浸膏，經(jīng)D101 樹脂純化，棄3 BV 純水與20%乙醇洗脫液，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏，冷藏備用。

2.2 降壓水包油微乳的制備 精密稱取吳茱萸和川芎精制提取物，加入肉豆蔻酸異丙酯，水浴加熱溶解，加入適量95%乙醇助溶，再加入乳化劑攪拌均勻，再加入助乳化劑，在25 ℃恒溫磁力攪拌器邊攪拌邊滴加超純水，至微乳形成澄清透明流動(dòng)性良好的微乳。記錄乳液由稀變稠和再由稠變稀相變點(diǎn)水的用量，以確定微乳區(qū)界限。

2.3 水包油微乳處方的優(yōu)選 根據(jù)微乳形成的基本原理和預(yù)試驗(yàn)初步確定如下試驗(yàn)用數(shù)據(jù)。表面活性劑與助表面活性劑的內(nèi)部比(Km值)為1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1。表面活性劑和助表面活性劑混合溶液與油相以9.5 ∶0.5、9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶ 5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8、1 ∶9、0.5 ∶9.5 比例進(jìn)行設(shè)組，作為試驗(yàn)用統(tǒng)一數(shù)據(jù)。Origin 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪制擬三元相圖，結(jié)果見表1。

表1 水包油微乳處方因素Tab.1 Prescription factors for oil-in-water microemulsion

2.3.1 油相的選擇 分別稱取3 份等量的吳茱萸和川芎干燥精制提取物，加入等量的油酸、異硬脂酸異丙脂和肉豆蔻異丙脂，攪拌均勻后超聲1 h，放置24 h，離心，取上清液，HPLC 測(cè)定吳茱萸堿、吳茱萸次堿和阿魏酸的含有量。結(jié)果3 種有效成分在肉豆蔻酸異丙酯中溶解度最大，因此選肉豆蔻酸異丙酯作為油相。

2.3.2 表面活性劑的選擇 選用HLB 值為8 ～18的表面活性劑，即吐溫-80、CO-40、吐溫-80 與CO-40 混合體系 (1 ∶1)。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)可知吐溫-80與CO-40 混合體系形成的水包油微乳區(qū)較大，因此選用吐溫-80 與CO-40 (1 ∶1)混合體系作為表面活性劑。

2.3.3 助表明活性劑的選擇及其微乳體系的制備現(xiàn)象

2.3.3.1 吐溫-80-CO-40-聚乙二醇400-肉豆蔻酸異丙酯體系 按照“2.2”項(xiàng)方法制備微乳，該體系在Km=1 ∶1、Km=2 ∶1、Km=3 ∶1 時(shí)，都不能形成澄清透明微乳。

2.3.3.2 吐溫-80-CO-40-乙醇-肉豆蔻酸異丙酯體系 按照“2.2”項(xiàng)方法制備微乳，當(dāng)Km=1 ∶1時(shí)，該體系在9.5 ∶0.5、9 ∶1、8 ∶2 比例形成澄清透明微乳，在7 ∶3 比例形成半透明乳液，其余比例形成凝膠。Km=2 ∶1 時(shí)，該體系在9.5 ∶0.5、9 ∶1、8 ∶2 比例形成澄清透明微乳，在7 ∶3 比例形成半透明乳液，其余比例形成凝膠。Km=3 ∶1時(shí)，該體系在9.5 ∶0.5、9 ∶1 比例形成澄清透明微乳，在8 ∶2、7 ∶3 比例形成半透明乳液。其余比例形成凝膠。但該體系所形成的澄清透明微乳在室溫下暴露放置一天會(huì)變渾濁，穩(wěn)定性差。

2.3.3.3 吐溫-80-CO-40-丙二醇-肉豆蔻酸異丙酯體系 按照“2.2”項(xiàng)方法制備微乳，當(dāng)Km=1∶1 時(shí)，該體系在9.5 ∶0.5、9 ∶1 比例能形成澄清透明微乳，在8 ∶2 比例形成半透明乳液，其余比例形成凝膠。Km=2 ∶1 時(shí)，該體系在9.5 ∶0.5、9 ∶1、8 ∶2 比例能形成澄清透明微乳，在7 ∶3 比例形成半透明乳液。其余比例形成凝膠。Km=3 ∶1 時(shí)，該體系在9.5 ∶0.5、9 ∶1 能形成澄清透明微乳，在8 ∶2、7 ∶3 比例形成半透明乳液，其余比例形成凝膠。該體系所形成的微乳較穩(wěn)定，室溫暴露放置性狀不變。故選用丙二醇作為該體系的助表面活性劑。

2.3.4 Km值的選擇 分別固定Km為1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1，將表面活性劑和助表面活性劑的混合溶液與油相按9.5 ∶0.5、9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8、1 ∶9、0.5 ∶9.5 比例磁力攪拌混勻，室溫下磁力攪拌時(shí)向混合液中滴加定量蒸餾水，觀察體系由稀變稠和由稠變稀的臨界點(diǎn)并記錄水的用量。計(jì)算臨界點(diǎn)體系各相組成部分的比例，origin 8.0 軟件作偽三元相圖，并計(jì)算相應(yīng)相圖的O/W 型微乳區(qū)面積，結(jié)果見圖1 (水作為一個(gè)頂點(diǎn)，表面活性劑與助表面活性劑的總量作為一個(gè)頂點(diǎn)，油作為一個(gè)頂點(diǎn)，所形成的左下角閉合區(qū)域?yàn)镺/W 微乳區(qū))。不同Km下的O/W 型微乳的面積是Km=2 ∶1 ＞Km=3 ∶1 ＞Km=1 ∶ 1，故選擇Km=2 ∶1，并從圖中微乳區(qū)內(nèi)選混合表面活性劑溶液與油相在9.5 ∶0.5 比例所對(duì)應(yīng)的處方量作為水包油微乳配方，即吐溫-80 ∶CO-40 ∶ 丙二醇∶肉豆蔻酸異丙酯∶水= 3.2 ∶3.2 ∶ 3.2 ∶0.5 ∶15.6。通過該微乳處方對(duì)吳茱萸和川芎提取物溶解度的考察，最佳溶解量均為0.15 g。

圖1 不同Km值的偽三元相圖Fig.1 Pseudo ternary phase diagrams with different Km

2.3.5 微乳類型的鑒定 15 000 r/min 離心15 min，不分層。采用染色法［10］，用油溶性染料蘇丹紅和水溶性染料亞甲藍(lán)在微乳中紅色和藍(lán)色的擴(kuò)散速度快慢來判斷微乳的類型，若紅色擴(kuò)散快于藍(lán)色則為W/O 型微乳，反之為O/W 型微乳。結(jié)果，按上述方法制備微乳配方離心不分層，藍(lán)色快于紅色，即為水包油微乳。

2.3.6 粒度檢測(cè) 測(cè)試溫度25 ℃，分散介質(zhì)為水，介質(zhì)黏度8.904 × 10-4Pa·s，介質(zhì)折射率1.333，角度90.0 Deg，延遲時(shí)間5 μs。測(cè)試結(jié)果Xav =50.57 nm，分散指數(shù)PI =0.470 2，見圖2。

圖2 微乳粒徑檢測(cè)條件及結(jié)果Fig.2 Condition and result of microemulsion particle size test

2.4 水包油微乳巴布劑的制備 將1 g 卡波姆用水定容至100 mL，充分?jǐn)嚢瑁胖?4 h 使其完全溶脹成1%卡波姆凝膠備用。先量取甘油置于燒杯中，然后加入NP-800，攪拌均勻，再加入甘羥鋁(先用水溶解)攪拌1 min，作為A 相。另外取一燒杯加入水和明膠，80 ℃水浴溶解，待充分溶解后加入酒石酸，作為B 相。再取一定量制備好的微乳加入卡波姆(用三乙醇胺調(diào)至中性)，兩者混合均勻作為C 相。然后先將B 相加入A 相中，攪拌5 min 至均勻。再將C 相加入混合均勻的A 相中攪拌10 min，至膏體均勻沒有結(jié)塊。再加入促滲劑冰片(適量無水乙醇溶解)，攪拌5 min，促滲劑分布均勻即可涂布成10 cm ×10 cm 大小，背面朝上放置一天晾干成型。

2.5 基質(zhì)處方評(píng)分指標(biāo)考察 參考文獻(xiàn)［11］，本實(shí)驗(yàn)選用雙面拒水無紡布作為巴布劑的背襯材料，并以內(nèi)聚力、初黏力、皮膚追隨性、反復(fù)揭貼性和外觀性狀為綜合考察指標(biāo)。

2.5.1 內(nèi)聚力測(cè)定［12］將3 cm ×3 cm 的巴布劑貼在垂直不銹鋼板上，下端2 cm 處掛700 g 的砝碼，記錄巴布劑滑移直至脫離的時(shí)間，用秒表記數(shù)。

2.5.2 初黏力測(cè)定［13］參照2010 年版《中國(guó)藥典》一部貼膏劑黏附力測(cè)定法第一法。取供試品3片，置于傾斜角30°的傾斜板中央，膏面向上，斜面上部10 cm 及下部15 cm 用0.025 mm 厚的滌綸薄膜覆蓋，中間留出5 cm 膏面，分別取不同規(guī)格的鋼球，自斜面頂端自由滾下。供試品中，3 片應(yīng)有2 片或2 片以上能在測(cè)試段上粘住鋼球，如有1片不能黏住，再用較小一號(hào)的鋼球試驗(yàn)，應(yīng)能黏住;如有1 片能黏住，而另2 片只能黏住較小一號(hào)的鋼球，則應(yīng)另取3 片復(fù)試。

2.5.3 感官評(píng)分 ①皮膚追隨性:取成型巴布劑3 片，每次取一片貼于手背，用力甩動(dòng)10 次未脫落者為滿分20 分。②外觀性狀:色澤均勻，膏體表面光潔，無顆粒感為滿分20 分。③反復(fù)揭貼性:反復(fù)揭貼10 次后仍保持良好的黏性為滿分20 分。

2.5.4 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［14］感官評(píng)分總分60 分，包括外觀性狀、皮膚追隨性和反復(fù)揭貼性這3 個(gè)指標(biāo)，各滿分為20 分;初黏力滿分20 分;內(nèi)聚力滿分20 分。綜合評(píng)分為感官評(píng)分、初黏力和內(nèi)聚力的總和，滿分100 分。具體見表2。

表2 巴布劑評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Criteria for scoring cataplasm

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化水包油微乳巴布劑基質(zhì)處方根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，初步確定微乳、NP-800、水和酒石酸作為微乳巴布劑的基本骨架，用量比例為20 ∶2 ∶18 ∶0.05。以甘羥鋁，甘油，卡波姆，明膠作為考察因素。基于處方的單因素考察確定水平范圍，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平見表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響微乳巴布劑質(zhì)量影響程度依次為B ＞A ＞C ＞D，以極差最小的D 因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，影響因素B (甘羥鋁)是影響水包油微乳巴布劑的主要因素，A 因素(甘油)為次要因素，C 因素(明膠)影響不顯著，結(jié)合直觀分析結(jié)果，確定正交試驗(yàn)優(yōu)選制備工藝為A2B1C2D4，即NP-800 ∶甘油∶甘羥鋁∶水∶明膠∶酒石酸∶卡波姆∶微乳=2 ∶13 ∶0.04 ∶18 ∶4.5 ∶0.05 ∶6 ∶20。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab.4 Result of orthogonal tests (n=3)

表5 方差分析結(jié)果Tab.5 Result of variance analysis

2.7 最佳處方的驗(yàn)證 以優(yōu)選的工藝條件制備3批樣品，測(cè)定其評(píng)價(jià)指標(biāo)，并進(jìn)行綜合評(píng)定。結(jié)果以優(yōu)化處方工藝制備的微乳巴布劑物理性能良好，綜合評(píng)分高，表明所選工藝合理、可行。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Result of verification tests

2.8 配方穩(wěn)定性考察 把制備好的微乳巴布劑室溫下存放30 d，膏體保濕性、黏性、柔軟性均符合巴布劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 討論

利用水包油微乳技術(shù)與常規(guī)巴布劑結(jié)合，可以使吳茱萸和川芎脂溶性有效成分更容易通過水溶性巴布劑基質(zhì)進(jìn)入皮下。在水包油微乳巴布劑的制備研究過程發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量控制的一些關(guān)鍵問題:水的用量是影響巴布劑藥物釋放的關(guān)鍵因數(shù)，它可以使皮膚角質(zhì)層水化，增加皮膚的通透性，而且對(duì)膏體的黏性也有一定的影響。含水量太少會(huì)影響藥物釋放，降低黏性，太多則會(huì)使膏體太軟，內(nèi)聚力不足。甘羥鋁是巴布劑的交聯(lián)劑，它的用量對(duì)巴布劑的膏體的黏性影響最大。用量過低，會(huì)造成膏體內(nèi)聚力小，容易產(chǎn)生殘留，過量則會(huì)造成膏體過硬，黏性過小。在制備微乳巴布劑過程中，已有的巴布劑配方不適合微乳巴布劑的制備，原因可能是微乳含有大量的表面活性劑和助表面活性劑，給巴布劑的制備造成了一定的困難。微乳巴布劑膏體的形成過程對(duì)基質(zhì)的混合順序、混合速度、混合方法有較高要求。

本實(shí)驗(yàn)只驗(yàn)證了幾種油相和表面活性劑、助表面活性劑形成微乳的工藝在巴布劑上的應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)乙醇作為助表面活性劑較容易形成微乳，但其穩(wěn)定性差，容易揮發(fā)，故不適合微乳的制備。本實(shí)驗(yàn)對(duì)其他微乳材料的工藝研究只能提供參考和方法?，F(xiàn)在國(guó)際上對(duì)微乳作為藥物載體的應(yīng)用前景的態(tài)度十分樂觀，而中藥有效成分大多數(shù)是脂溶性成分，特別是巴布劑制備中，親水性基質(zhì)限制了巴布劑的制備和推廣，因此開發(fā)新的微乳制備工藝并將微乳工藝更好的應(yīng)用在巴布劑制備上是未來的巴布劑發(fā)展方向之一。

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