桂書彥 韓 瑾 葉 強 李 靜 陳立波

近年較多的研究顯示Wnt 信號通路在生物的代謝平衡調節(jié)以及糖尿病等其他代謝相關疾病中有著重要的影響和作用。2006 年關于TCF7L2 單核苷酸多態(tài)性與2 型糖尿病發(fā)病易感性研究的新發(fā)現，已經再次激起了Wnt 信號通路與胰島β 細胞功能及糖代謝調節(jié)的研究熱潮。

前期，筆者采用小鼠來源的NIT -1 胰島β 細胞進行研究，通過重組蛋白Wnt3a 外源性激活經典的Wnt/β-catenin/TCF 通路，增加了細胞內β -catenin的蛋白水平和下游TCF7L2 的轉錄活性，通過調節(jié)與β 細胞生長和功能密切相關的靶基因的表達實現對β 細胞的增殖、凋亡和功能的調節(jié)作用，參與2 型糖尿病的發(fā)病機制。但是，在這些調節(jié)作用的具體實現中有諸多的分子生物學機制仍是未知和假想的，有待于進一步的研究來探討和證實。在本研究中，筆者擬嘗試通過誘導2 型糖尿病大鼠模型，研究Wnt 信號通路中關鍵蛋白β -catenin、TCF7L2 的轉錄與表達，了解Wnt 通路與2 型糖尿病大鼠發(fā)病機制的關聯。

材料與方法

1.材料:35 只雄性Wistar 大鼠及高脂高糖飼料購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。鏈脲佐菌素(STZ)、牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma 公司;Western 及IP 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)、DAPI、Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔IgG(H +L)、Cy3 標記的山羊抗小鼠IgG(H +L)、小鼠抗β -actin 單克隆抗體等相關試劑購自碧云天生物技術研究所;兔抗TCF7L2 多克隆抗體、兔抗β-catenin 單克隆抗體購自Abcam 公司。小鼠抗insulin單克隆抗體、兔抗Ki67 多克隆抗體購自武漢谷歌生物科技有限公司。

2.分組及模型建立:雄性Wistar 大鼠35 只，體重200 ～220g，喂養(yǎng)在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院動物實驗中心，自由進食、飲水，室內溫度20 ～25℃，濕度40% ～50%。隨機分兩組，每組10 只，正常對照組(NC 組)，給予普通飲食，2 組25只，造模實驗組，給予高脂高糖飲食(高脂高糖飼料:其比例為豬油15%，蔗糖20%，蛋黃3%，基礎飼料62%。購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心)。喂養(yǎng)8 周后，實驗組進行造模。隔夜禁食12h，實驗組大鼠給予用0.1mmol/L 枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.4)新鮮配制的1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液避光冰浴，25mg/kg，腹腔注射，正常對照組大鼠僅注射檸檬酸鈉緩沖液25mg/kg。注射后第6、7 天連續(xù)2 次剪尾測隨機血糖＞16.7mmol/L 即可納入實驗組。

3.取材及標本制備:實驗組及對照組大鼠繼續(xù)高脂高糖和普通飲食喂養(yǎng)4 周后，禁食8h，稱重測血糖，10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死，立即分離胰腺置液氮保存，留待提取蛋白質。部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，制作石蠟切片，用于免疫組化及免疫熒光檢測。

4.免疫熒光檢測胰島TCF7L2、β -catenin 組織表達及β細胞的增殖:將石蠟切片脫蠟水化，用檸檬酸抗原修復液進行抗原修復后，加入5%BSA 稀釋的抗insulin(1∶100 稀釋)、抗TCF7L2(1∶100 稀釋)、抗β -catenin(1∶200 稀釋)或抗Ki67(1∶200 稀釋)抗體，二抗對照組加入等體積的5% BSA，置于4℃孵育過夜。PBS 洗3 次后，加入Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔IgG(H +L)(1∶400 稀釋)和Cy3 標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶300 稀釋)混合液，室溫下避光孵育1h。PBS洗3 次，加入終濃度為1μg/ml 的DAPI 溶液，置于室溫避光孵育10min，以復染細胞核。用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照，熒光強度用Image Pro Plus 6.0 軟件進行分析。

5.免疫組化檢測胰島組織β 細胞凋亡:按照TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒的操作說明書，檢測凋亡細胞。Insulin 染色方法如上所述，二抗為堿性磷酸酯酶標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶2000 稀釋)。

6.Western blot 法檢測TCF7L2 及β -catenin 蛋白表達:向凍存的胰腺組織加入適量Western 及IP 裂解液，用勻漿器充分研磨后，將組織勻漿液置于冰上振搖孵育30min，于4℃離心，13000g×10min，吸取上清液，用BCA 法測定蛋白質的濃度。每組各取50μg 總蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白條帶轉印至PVDF 膜，用10%的脫脂奶粉于室溫封閉3h后，分別加入1∶1000 稀釋的兔抗TCF7L2 多克隆抗體、1∶2000稀釋的兔抗β-catenin 單克隆抗體和1∶2000 稀釋的兔抗βactin 單克隆抗體，置于4℃孵育過夜。TBST 洗3 次，分別加入1∶8000 稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(H+L)二抗和1∶5000 稀釋的HRP 標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗，室溫下孵育1.5h。用ECL 化學發(fā)光試劑盒顯色，并行X 線片曝光。蛋白條帶用凝膠成像系統掃描和進行灰度分析，以目的蛋白與β -actin 條帶的灰度比值表示其相對表達量。

7.統計學方法:所有實驗數據均進行正態(tài)性檢驗，并以均數±標準差(±s)表示，采用SPSS 17.0 軟件分析。兩組間用獨立t 檢驗，多組間兩兩比較采用單因素方差分析(one -way ANOVA)。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

光鏡下觀察正常對照組胰島呈團狀，邊界清晰，細胞核呈橢圓形，胞質豐富，胰島數量及島內細胞數目較多，高倍鏡/低倍鏡視野中平均10 ～15 個胰島。糖尿病模型組鏡下胰腺組織中胰腺萎縮，胰島數量減少，體積縮小，視野中平均5 ～8 個胰島(圖1)。

圖1 HE 染色光鏡下觀察胰腺

Wistar 大鼠經高脂高糖飲食聯合小劑量STZ 處理成模后，比較糖尿病模型組體重(BW)低于與對照組，差異無統計學意義(P ＞0.05)。糖尿病模型組血糖(BG)顯著高于對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。免疫熒光通過Ki67 及胰島素雙標檢測胰島細胞增值率9(圖2)。Ki67 染色陽性代表增殖細胞，insulin 染色陽性代表胰島β 細胞，鏡下計數Ki67 + /Insulin+細胞和Insulin +細胞比值代表胰島細胞增殖率。同樣，TUNEL+細胞與Insulin+細胞比值代表胰島細胞的凋亡率(圖3)。DM 組胰島細胞的增殖率高于NC 組，差異有統計學意義(P ＜0.05);DM 組胰島細胞凋亡率明顯高于NC 組，差異有統計學意義(P ＜0.05)，詳見表1。

圖2 Ki67 檢測細胞增殖

圖3 TUNEL 檢測細胞凋亡

取胰島內TCF7L2 相對表達面積代表胰島組織內TCF7L2 表達水平，結果顯示DM 組胰島細胞TCF7L2 表達顯著高于正常對照組(P ＜0.05);β -catenin 表達差異不明顯(圖4、圖5)。

Western blot 法檢測糖尿病大鼠模型組TCF7L2蛋白表達水平高于正常對照組(P ＜0.05)，詳見圖6，與免疫熒光檢測結果一致。

討 論

迄今為止，眾多研究已經證實TCF7L2 與2 型糖尿病之間有著密切的聯系。2006 年，兩個前驅研究首次發(fā)現和提出了Wnt/β -catenin 信號調節(jié)的一個轉錄因子TCF7L2，其基因多態(tài)性與2 型糖尿病發(fā)病風險增加密切相關。并在隨后的不同國家和人種群體中進行了大量的遺傳學研究，均證實了轉錄因子TCF7L2 是2 型糖尿病的最強易感基因［1］。但是TCF7L2 的遺傳變異性對2 型糖尿病發(fā)病風險的具體影響機制仍然不詳。TCF7L2 在多種組織中表達，其中包括胰腺，毫無疑問，TCF7L2 可以直接影響胰腺胰島β 細胞的功能。但是TCF7L2 的轉錄與翻譯要受到多種因素包括細胞內各種微環(huán)境影響，同時，它可以通過多種轉錄途徑調控下游靶基因的表達，實現對胰島β 細胞功能及數量的作用及影響［2］。

表1 模型組與對照組體重、血糖及增殖、凋亡比較(±s)

表1 模型組與對照組體重、血糖及增殖、凋亡比較(±s)

NC.正常對照組;DM.糖尿病大鼠模型組;與NC 組比較，△P ＜0.05，#P ＜0.01

項目 0周8周12周NC DM NC DM NC DM體重(g) 174.10 ±12.00 180.00 ±11.00 232.30 ±3.23 247.80 ±2.47 265.20 ±13.00 249.10 ±16.00血糖(mmol/L) 5.06 ±0.35 5.24 ±0.36 5.05 ±0.43 18.44 ±1.98 5.78 ±0.19# 28.08 ±0.84#凋亡細胞/islet 1.76 ±0.31△ 7.64 ±0.77△增殖細胞/islet 0.15 ±0.01△ 0.06 ±0.01△

圖4 免疫熒光檢測TCF7L2 表達:

圖5 免疫熒光檢測β-catenin 表達

圖6 Western blot 法檢測TCF7L2 及β-catenin 表達

盡管Wnt 通路及其關鍵基因TCF7L2 與2 型糖尿病發(fā)病有著密切相關性已成共識，但是目前研究關于Wnt 通路及TCF7L2 對胰島的具體作用還存在很多的未知和分歧。細胞內存在著縱橫交錯的復雜的調控網絡體系，Wnt 通路可能與胰島素、FOXO 等其他信號通路之間互相影響及作用，實現對體內葡萄糖及其他代謝平衡的調控［3］。同樣，Wnt 信號通路對胰島細胞的作用也是一個復雜得過程。筆者在前期的細胞系研究中發(fā)現，Wnt 不僅可以通過激活下游TCF7L2 的轉錄活性，調節(jié)與β 細胞生長和功能密切相關的靶基因的表達，實現對胰島細胞的直接作用，還可能通過胰島素信號通路中IRS - 2 及其下游PI3K/AKT 通路，間接調節(jié)胰島β 細胞增殖、凋亡及胰島素釋放功能［4］。

本研究中，筆者采用傳統的高脂、高糖飲食誘導肥胖及胰島素抵抗大鼠，小劑量STZ 誘導胰島β 細胞的損傷，使其胰島素分泌功能缺損，構建模擬人類2 型糖尿病大鼠模型。糖尿病組大鼠血糖顯著高于正常對照組大鼠。胰腺組織的HE 染色提示胰腺萎縮及胰島的數量減少。而且通過對兩組大鼠胰腺組織的石蠟切片免疫組化檢測，發(fā)現糖尿病大鼠組中胰島細胞凋亡增加，增殖減少。同時，筆者采用免疫熒光及Western blot 法檢測了胰腺組織的TCF7L2 及β-catenin 的表達，發(fā)現糖尿病大鼠的TCF7L2 和β -catenin 的表達是明顯高于正常對照大鼠的。TCF7L2及β-catenin 是Wnt 信號通路中的關鍵效用靶基因，TCF7L2 表達增多提示Wnt 通路的激活狀態(tài)，研究結果提示糖尿病大鼠的Wnt 通路可能是處于激活的，而正常對照大鼠的Wnt 通路處于相對靜息狀態(tài)。Wnt 通路的激活/TCF7L2 的增加是糖尿病發(fā)生的因還是果?TCF7L2 對胰島細胞究竟是保護還是損傷作用仍是未知的。早期Schinner 等［5］通過體外分離培養(yǎng)人和小鼠的原代胰島β 細胞發(fā)現，抑制TCf7L2 表達后，胰島β 細胞的凋亡增加，增殖減少，胰島素分泌減少，相反使TCf7L2 過表達后，則可以保護β 細胞的糖毒性和細胞因子毒性。體外細胞實驗顯示TCF7L2 表達增加，促進胰島細胞增殖及胰島素釋放，而糖尿病患者或危險基因攜帶者胰島β 細胞中TCF7L2 表達是增加的［6］。本研究發(fā)現糖尿病大鼠模型中的TCF7L2 表達是增加的，結果提示TCF7L2可能對胰島細胞有潛在的破壞作用，這個與之前在細胞系研究中所得出TCF7L2 對胰島細胞的保護作用結論卻是相悖的［6，7］。同樣另外一項研究發(fā)現，在不同的嚙齒類動物的2 型糖尿病模型中，胰島的TCF7L2 的mRNA 水平是升高的，但是蛋白水平卻是降低的［7］。

這些來自不同研究所得出的關于TCF7L2 在胰島中發(fā)揮有利或有害作用這些看似相互矛盾的結論，可能與TCF7L2 在同一種細胞內，有不同的表達形式即剪接體有關(不同的剪接體，它們轉錄的模版是一樣的，但外顯子不太一樣，所以翻譯成蛋白后功能會有差異;還有可以指蛋白的修飾水平不同，比如乙酰化修飾、磷酸化修飾等)。最近的一項研究結果顯示，胰島β 細胞中不同表達形式的TCF7L2 會對細胞的生存、功能和Wnt 激活產生相反的作用［8］。

綜上所述，TCF7L2 可能通過在細胞內形成不同的剪接體選擇性作用于胰島β 細胞的增殖、凋亡及功能，從而成為胰島細胞損傷及2 型糖尿病發(fā)生的一個重要因素。但是有關2 型糖尿病的TCF7L2 風險單核苷酸多態(tài)性與TCF7L2 的選擇性剪切之間的重要關聯仍有待于開展進一步研究。在TCF7L2 的編碼區(qū)、或確定能影響TCF7L2 表達及可變剪接的區(qū)域內，并沒有出現能導致2 型糖尿病的風險性單核苷酸多態(tài)性。TCF7L2 對胰島β 細胞的作用和影響是極其復雜的，筆者預測在不久的將來，人們會對胰島及胰腺外組織的TCF7L2 單核苷酸多態(tài)性和其可變剪接之間的關系會進行更深入地探索。通過對不同組織內的各種TCF7L2 剪接體正反效應的研究，能夠更進一步闡明2 型糖尿病的發(fā)病機制，并為糖尿病的治療和預防提供新的思路。

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2 Renstr?m E. Impact of transcription factor 7 - like 2 (TCF7L2)on pancreatic islet function and morphology in mice and men［J］.Diabetologia，2012，55:2559 -2561

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4 Gui SY，Yuan G. Wnt3a regulates proliferation，apoptosis and function of pancreatic NIT -1 beta cells via activation of IRS2/PI3K signaling［J］. J Cell Biochem，2013，114:1488 -1497

5 Schinner S，Willenberg HS，Schott M，et al. Pathophysiologicall aspects of Wnt—signaling in endocrine disease［J］. Horm Metab Res，2009，41:159 -163

6 Shu L，Sauter NS，Schulthess FT，et al. Transcription factor 7 - like 2 regulates B cell survival and function in human pancreatic islets［J］.Diabetes，2008，57:645 -653

7 Shu L，Matveyenko AV，Kerr-Conte J，et al.Decreased TCF7L2 protein levels in type 2 diabetes mellitus correlate with downregulation of GIP- and GLP -1 receptors and impaired beta - cell function［J］.Hum Mol Genet，2009，18:2388 -2399

8 Le Bacquer O，Shu L，Marchand M，et al.TCF7L2 splice variants have distinct effects on betacell turnover and function［J］. Hum Mol Genet，2011，20:1906 -1915