張金蓮， 李志強(qiáng)， 余書(shū)琦， 曾昭君， 陳 香

（江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004）

單葉蔓荊子提取工藝研究

張金蓮， 李志強(qiáng)， 余書(shū)琦， 曾昭君， 陳 香

（江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004）

目的優(yōu)化單葉蔓荊子的提取工藝。方法在優(yōu)化提取溫度和時(shí)間的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、粉碎度和提取次數(shù)為考查因素，以浸膏得率、總黃酮含有量和蔓荊子黃素含有量為考查指標(biāo)，采用綜合加權(quán)評(píng)分法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果優(yōu)化后的提取工藝為藥材經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，加8倍量50%的乙醇，提取時(shí)間1 h，提取3次。結(jié)論該方法可行、穩(wěn)定。

單葉蔓荊子；提取工藝；綜合加權(quán)評(píng)分法；正交設(shè)計(jì)

蔓荊子為常用中藥，以 “蔓荊實(shí)”之名始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［1］，為馬鞭草科植物單葉蔓荊Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.或蔓荊Vitex trifolia L.的干燥成熟果實(shí)，有疏散風(fēng)熱、清利頭目之功效［2］。該植物主產(chǎn)于我國(guó)江西、山東、浙江、安徽、福建等地［3-4］，臨床上常用于治療風(fēng)熱感冒頭痛、齒齦腫痛、目赤多淚、頭暈?zāi)垦＃绕湓谥委熞灶^痛為主的多種疼痛癥狀方面療效顯著［5-6］。黃酮類(lèi)化合物是蔓荊子鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎等藥理作用的主要藥效成分［7-10］，其中蔓荊子黃素含有量是衡量其優(yōu)劣的重要依據(jù)［2］。但中藥的藥效是多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果，故本實(shí)驗(yàn)以江西主產(chǎn)的單葉蔓荊子為研究對(duì)象，以浸膏得率、總黃酮含有量和蔓荊子黃素含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選該中藥的提取工藝。

1 儀器和材料

1.1 儀器 ultimate 3000高效液相色譜儀，包括ultimate 3000自動(dòng)進(jìn)樣器、ultimate 3000柱溫箱、ultimate 3000色譜工作站（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津儀器公司）；Sartorius BS124電子天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 （國(guó)華電器有限公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī) （天津市泰斯特一儀器有限公司）；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器 （上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；KQ3200超聲波清洗器 （昆山超聲儀器廠(chǎng)）；GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 對(duì)照品及試劑 蔓荊子黃素對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111554-200503）；蘆丁對(duì)照品 （四川維克奇生物科技有限公司）。分析純亞硝酸鈉 （天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)）；分析純硝酸鋁 （西隴化工股份有限公司）；分析純氫氧化鈉 （天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；色譜純甲醇 （美國(guó)Merck公司）；水為超純水 （自制）；其他試劑均為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 單葉蔓荊子購(gòu)自江西新建縣厚田鎮(zhèn)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)科組賴(lài)學(xué)文副教授鑒定為馬鞭草科植物單葉蔓荊Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸膏得率 精密稱(chēng)取10 g單葉蔓荊子 （M），按L9（34）正交試驗(yàn)表中的條件進(jìn)行提取，然后合并提取液，過(guò)濾，置于恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴上濃縮蒸干，得到蔓荊子提取物 （m）。按 《中國(guó)藥典》2010版ⅨH水分測(cè)定法第一法來(lái)測(cè)定提取物的含水量 （%），得浸膏得率（%）=m×（1-含水量%）÷M×100%，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2 蔓荊子黃素測(cè)定

2.2.1 色譜條件［2］Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液 （60∶40）；柱溫30℃；體積流量1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm；理論塔板數(shù)按蔓荊子黃素計(jì)算，不得低于2 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品和蔓荊子提取物的HPLC色譜圖

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取 “2.1”項(xiàng)下的蔓荊子提取物，用甲醇溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液備用。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定蔓荊子黃素對(duì)照品，置于50mL量瓶中，用甲醇溶解，定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液，每1mL含蔓荊子黃素30μg。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取蔓荊子黃素對(duì)照品溶液4、8、16、20、24、32μL，依次注入液相色譜儀中，以峰面積為縱坐標(biāo) （Y），對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得曲線(xiàn)方程Y=55.986X-0.169 3（r2=0.999 8，n=6）。結(jié)果表明，蔓荊子黃素在0.12～0.96μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取蔓荊子黃素對(duì)照品溶液10μL，“2.2.1”項(xiàng)條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值。結(jié)果測(cè)得RSD為1.31%，說(shuō)明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，“2.2.1”項(xiàng)條件下于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10μL，記錄峰面積值。結(jié)果測(cè)得RSD為0.27%，說(shuō)明該溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取3號(hào)蔓荊子提取物，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份， “2.2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定。結(jié)果測(cè)得RSD為0.87%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取3號(hào)蔓荊子提取物，并精密加入蔓荊子黃素對(duì)照品，按 “2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果測(cè)得蔓荊子黃素的平均加樣回收率為102.23%，RSD為1.44%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 蔓荊子總黃酮的測(cè)定［11-12］

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品11.24 mg，置于50 mL量瓶中，用70%乙醇溶解，定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液，每1 mL含無(wú)水蘆丁0.224 8 mg。

2.3.2 測(cè)定方法 精密吸取 “2.1”項(xiàng)下蔓荊子提取物，用70%乙醇溶解，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL（放置6min）、10%硝酸鋁溶液1mL（放置6min）、4%NaOH溶液10mL，搖勻。之后加入70%乙醇，定容至25 mL量瓶中，放置20 min，采用紫外分光光度法于504 nm處測(cè)定吸光度。

2.3.3 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取 “2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，按 “2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，以吸光度 （A）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程A=0.009 5C-0.032 1（r2=0.999 2）。結(jié)果表明，蘆丁在8.992～53.952 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸收值。結(jié)果測(cè)得RSD為2.17%，說(shuō)明精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，分別在0、15、30、60、90、120 min測(cè)定，記錄吸收值。結(jié)果測(cè)得RSD為0.73%，說(shuō)明該溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取3號(hào)蔓荊子提取物，按 “2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品6份進(jìn)行測(cè)定，記錄吸收值。結(jié)果測(cè)得RSD為1.40%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取3號(hào)蔓荊子提取物，加入蘆丁對(duì)照品，按 “2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品6份進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果測(cè)得平均回收率為97.88%，在95%～105%范圍內(nèi)，RSD為0.75%。

2.4 正交試驗(yàn)

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù) （A）、乙醇用量 （B）、粉碎度 （C）、提取次數(shù)（D）為考查因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，設(shè)定因素水平表，見(jiàn)表2。

表2 正交因素水平

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 按照L9（34）正交設(shè)計(jì)表的條件進(jìn)行試驗(yàn)，分別測(cè)定浸膏得率、提取物總黃酮含有量和蔓荊子黃素的含有量，計(jì)算提取率，并進(jìn)行綜合加權(quán)評(píng)分。由于單葉蔓荊子的主要黃酮類(lèi)化合物為蔓荊子黃素，且其含有量為 《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定的蔓荊子質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，故在正交試驗(yàn)結(jié)果的總體評(píng)價(jià)中，以蔓荊子黃素的提取率為主，權(quán)重系數(shù)為0.7；總黃酮提取率和浸膏得率為輔，權(quán)重系數(shù)分別為0.2和0.1，以綜合值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，綜合評(píng)分值M=（0.1X/17.82+0.7Y/0.163+0.2Z/3.205）×100，結(jié)果見(jiàn)表3～4。

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

分析表明，根據(jù)極差R的大小，可以判斷各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。由表3可以看出，R3＞R4＞R2＞R1，所以各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序?yàn)镃＞D＞B＞A，即藥材的粉碎度影響最大，其次為提取次數(shù)和溶劑用量，而乙醇體積分?jǐn)?shù)影響最小。表4方差分析發(fā)現(xiàn)，C（粉碎度）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響 （P＜0.05），而B(niǎo)（乙醇用量）和D（提取次數(shù)）則無(wú)顯著性影響 （P＞0.05）。同時(shí)在比較F值大小時(shí)，可以判斷各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)镃＞D＞B，與直觀分析結(jié)果相同。綜上所述，確定A1B1C3D3為最適宜的提取工藝，即藥材經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，加8倍量50%的乙醇，提取3次，每次1 h。

2.5 優(yōu)選工藝驗(yàn)證 為了保證提取工藝的重復(fù)性和可行性，對(duì)優(yōu)選的方案A1B1C3D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知，該工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 蔓荊子的主要活性成分為黃酮類(lèi)化合物，多以苷元的形式存在，脂溶性較強(qiáng)［13-14］。該類(lèi)成分以蔓荊子黃素為主，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿等溶劑，其中乙醇是中藥大生產(chǎn)提取常用的溶媒，易于回收，價(jià)格便宜，因此選擇乙醇為提取溶劑。

3.2 單次提取時(shí)間的選擇 通過(guò)比較單次提取時(shí)間（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h）對(duì)蔓荊子浸膏得率、總黃酮含有量和蔓荊子黃素含有量的影響，發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間越長(zhǎng)，其得率和含有量越高，而且在1.0 h、1.5 h、2.0 h內(nèi)無(wú)顯著性差異。綜合考慮提取效率和資源節(jié)約，故確定單次提取時(shí)間為1.0 h。

3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取供試品溶液，以70%乙醇為空白對(duì)照，加入顯色劑，按紫外分光光度法在450～800 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果供試品溶液在504 nm處產(chǎn)生最大吸收，故選擇504 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.4 考察指標(biāo)選擇 蔓荊子疏散風(fēng)熱、清利頭目的功效不是某個(gè)單一成分作用的結(jié)果，而是由多種物質(zhì)共同作用所致，故應(yīng)綜合考慮浸膏得率、總黃酮、蔓荊子黃素等多個(gè)考察指標(biāo)。由于蔓荊子黃素是 《中國(guó)藥典》規(guī)定的檢測(cè)指標(biāo)，也是蔓荊子藥效的主要物質(zhì)之一，故在分配權(quán)重系數(shù)時(shí)，蔓荊子黃素定為0.7，總黃酮定為0.2，浸膏得率定為0.1，這種多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法可避免單一評(píng)價(jià)的片面性，使分析指標(biāo)更全面，同時(shí)對(duì)關(guān)鍵影響因素又給予相應(yīng)側(cè)重，使分析結(jié)果更為客觀。雖然有效成分是中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，但由于中藥成分復(fù)雜多樣，故應(yīng)在成分考察的基礎(chǔ)上，對(duì)相關(guān)動(dòng)物模型進(jìn)行深入研究，結(jié)合反映藥效的指標(biāo)來(lái)優(yōu)化提取工藝，為蔓荊子提取物的生產(chǎn)工藝提供可靠的參考依據(jù)。

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2014-04-12

江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃課題資助項(xiàng)目 （2013Z003）；江西中醫(yī)藥大學(xué)道地藥材及特色中藥資源研究專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目（ZX1016）

張金蓮 （1969—），女，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥學(xué)教學(xué)研究。Tel：（0791）87118995，E-mail：jxjzzjl@ 163.com