周 凌， 尹素改， 吳耀松， 王慧慧， 陳玉龍

（河南中醫(yī)學院分子生物實驗中心，河南鄭州450046）

六君子湯對食管癌細胞株EC9706致血管生成的影響

周 凌， 尹素改， 吳耀松， 王慧慧， 陳玉龍*

（河南中醫(yī)學院分子生物實驗中心，河南鄭州450046）

目的研究六君子湯對食管癌血管生成的影響。方法MTT法檢測六君子湯醇提物對食管癌細胞株EC9706生長抑制作用，收集其500μg/mL質量濃度的EC9706細胞條件培養(yǎng)基用于雞胚絨毛尿囊膜的血管生成、人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移和小管形成的觀察。ELISA法檢測EC9706細胞和人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)基上清中VEGF和IL-6含有量。結果六君子湯醇提物可明顯抑制EC9706細胞增殖，具一定劑量依賴性，其IC50值為505.28μg/mL。六君子湯醇提物可減少EC9706細胞條件培養(yǎng)基所致雞胚絨毛尿囊膜血管生成、人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移和小管形成。六君子湯醇提物可減少EC9706細胞和內皮細胞IL-6及內皮細胞VEGF分泌。結論六君子湯醇提物可能通過干預EC9706細胞信號通路從而抑制血管生成的效應。

六君子湯；食管癌細胞株EC9706；人臍靜脈內皮細胞；雞胚絨毛尿囊膜；血管生成；VEGF；IL-6

六君子湯是治療或輔助治療腫瘤的有效方劑。研究表明，該方能夠抑制H22小鼠肝癌移植瘤生長，增加體質量、延長存活時間，誘導肺癌細胞SPA-A1和胃癌細胞BGC2823凋亡［1-2］。對人食管癌細胞株Eca109和人肝癌細胞株HepG2的生長有不同程度抑制作用，具有明顯劑量依賴性［3］。臨床觀察表明，它可以減輕放化療引起的惡心、嘔吐、食欲減退、白細胞減少等毒性作用，提高外周血淋巴細胞轉化率、NK細胞活性、輔助T細胞與抑制T細胞比率等免疫指標。應用該方治療進展期胃癌，能改善生活質量，穩(wěn)定腫瘤病灶，延長生存期［4-5］。腫瘤血管生成是決定腫瘤生長、轉移、復發(fā)及預后的關鍵因素之一。六君子湯是否可以抑制食管癌血管生成，尚未見報道，因此本實驗對此進行研究。

1 材料

1.1 藥物 六君子湯參照 《醫(yī)學正傳》組方，藥物組成與比例為人參-白術-茯苓-甘草-陳皮-半夏（2∶3∶2∶2∶2∶3）；藥物購于河南中醫(yī)學院三附院，經(jīng)河南中醫(yī)學院苗艷艷副研究員鑒定為真品。1.2 細胞株和受精種蛋 人食管癌細胞株EC9706，由河南中醫(yī)學院分子生物實驗中心提供；人臍靜脈內皮細胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECS）第4代，購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；受精種蛋，購于鄭州市惠濟區(qū)豐樂農(nóng)莊。

1.3 試劑 RPMIMedium 1640、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液、四甲基偶氮唑藍MTT（北京索萊寶科技有限公司）；二甲基亞砜DMSO（美國Amresco公司）；四季青胎牛血清（北京雅安達生物技術有限公司）；Matirgel基質膠（美國BD公司）；血管內皮細胞生長因子ELISA試劑盒；人白介素-6 ELISA試劑盒（中國Boste公司）。

1.4 儀器設備 Heraeus細胞培養(yǎng)箱（德國Kendro公司）；倒置顯微鏡 （德國ZESS公司）；紫外分光光度計BioMate（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SG-603生物安全柜 （美國Bake公司）；ELx800型酶標儀（美國BioTek公司）；3422型Transwell小室（美國Corning公司）；微電腦全自動孵化機（德州愛華孵化設備廠）；OlympusSZ61變焦體視顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 藥物提取 藥量按照上述比例稱取每味藥物對等克數(shù)，質量∶體積=1∶10加入85%乙醇浸泡7 d，每日震蕩兩次，混勻。用旋轉蒸發(fā)儀濃縮藥液，真空干燥箱干燥。DMSO充分溶解配置100 mg/mL的母液，0.22μm過濾除菌，-20℃冰箱保存，備用。

2.2 細胞培養(yǎng) EC9706細胞和人臍靜脈內皮細胞株HUVECS于含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃飽和濕度，體積分數(shù)為5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液一次，細胞長到80%時傳代一次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.3 細胞生長抑制作用 以1×104EC9706細胞/孔接種96孔平面培養(yǎng)板，于37℃，5%CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。設對陰性照組、六君子湯藥物組 （質量濃度分別為2 000、1 600、1 280、1 024、820、654μg/mL），每組4個復孔，陰性對照組培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)液及與用藥組相等劑量的DMSO。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入MTT，4 h后DMSO溶解，用酶標儀在波長為570 nm（/630 nm），測定吸光度 （A）。按公式計算抑制率。抑制率=（1-實驗孔平均 A570/630值/對照孔平均A570/630值） ×100%。

用同樣方法，檢測 “2.4”項條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內皮細胞HUVECS抑制作用。

2.4 條件培養(yǎng)基制備 以1×106EC9706細胞/孔接種φ100培養(yǎng)皿，于37℃，5%CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，加入六君子湯 500 μg/mL，陰性對照為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集上清，離心，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 EC9706細胞條件培養(yǎng)基對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響 新鮮受精種蛋，消毒，氣室向上，放入37.8℃、相對濕度65%培養(yǎng)箱中，每2 h翻轉1次；7日齡的種蛋標記氣室；8日齡的雞胚在蛋殼鈍端開小孔約0.2～0.3 mm，暴露胚絨毛尿囊膜（Chick embryo chorioallantoicmembrane，CAM），用醫(yī)用敷貼封閉氣室端，放入孵化箱繼續(xù)培養(yǎng)。開窗后第2天，將制備好的厚約2 mm的硅膠片置于每枚雞胚CAM表面兩條主干血管 （卵黃靜脈）之間相對無血管區(qū)。將種蛋隨機分為4組，即空白對照組 （培養(yǎng)基）、腫瘤條件培養(yǎng)基組、六君子湯條件培養(yǎng)基組，每組10只。加上述液體于載體上，20μL/胚，封口，放入孵化箱繼續(xù)培養(yǎng)。孵育至第11天，揭去醫(yī)用敷貼，假氣室內加入甲醇、丙酮按1∶1比例混合后的混合液固定，最大程度暴露CAM，以載體為中心用眼科剪完整剪下CAM，平鋪于加有固定液的培養(yǎng)平皿中。解剖顯微鏡（10倍）下拍照，用Image-pro plus軟件對照片進行處理，選取以實際面積計為1.5 cm× 1.5 cm大小的尿囊膜，以測定吸光度 （A）反映血管面積。

2.6 EC9706細胞條件培養(yǎng)基對HUVECS遷移的影響 取細胞懸液3×104個/孔加入Transwell 24孔板上室，24孔板下室加入500μL/孔高糖DMEM完全培養(yǎng)基，每組設置3個復孔，即空白對照組、腫瘤條件培養(yǎng)基組、六君子湯條件培養(yǎng)基組，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后將板從培養(yǎng)箱中取出，于超凈臺內吸出孔內藥液，用棉簽將上室內細胞擦去，下室每孔加入MTT，4 h后DMSO溶解，用酶標儀在波長為570 nm（/630 nm），測定吸光度 （A）。

2.7 EC9706細胞條件培養(yǎng)基對HUVECS小管生成的影響 Matrigel基質膠4℃過夜凍融，用預冷的移液槍頭混勻Matrigel基質成勻漿狀，1∶3無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，將96孔培養(yǎng)板置于冰上，加入濃度為50μL/cm2生長面積的Matrigel基質膠，在37℃放置30 min成膠。按細胞懸液2×104個/孔加入板中，放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分為空白對照組、腫瘤條件培養(yǎng)基組、六君子湯條件培養(yǎng)組，加入上述液體，每組設置5個復孔。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。光學顯微鏡下觀察內皮細胞小管的形成情況，每孔隨機取5個視野，數(shù)碼相機拍照，計數(shù)形成的小管的個數(shù)。

2.8 六君子湯對HUVECS、EC9706細胞株分泌IL-6和VEGF水平的影響 以1×106EC-9706細胞/孔、1×106HUVECS細胞/孔接種于φ100培養(yǎng)皿，于37℃，5%CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，加入六君子湯500μg/mL，陰性對照為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集上清，離心，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

嚴格按照ELISA說明書進行，往預先包被待測樣品的包被微孔中，依次加入標本 （上述各組培養(yǎng)基上清）、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌，TMB顯色，于酶標儀上在450 nm測吸光度 （A）。

2.9 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行ANOVA方差分析后，再進行LSD-t檢驗，測P＜0.05有統(tǒng)計學意義，回歸分析進行曲線擬合，應用概率法計算半數(shù)抑制率。

3 結果

3.1 六君子湯對人食管鱗癌細胞EC9706增殖的抑制作用 六君子湯各質量濃度組作用EC9706細胞48 h后，抑制率隨質量濃度的增加而增加，呈現(xiàn)一定的量效關系，方程為：4.6×10-7x2+ 0.001 523x-0.270 66，（r2=0.980，F(xiàn)=75.107，P=0.001），應用概率法 95%置信區(qū)間 IC50： 505.28μg/mL。結果見表1。

表1 六君子湯對人食管鱗癌細胞EC9706增殖的抑制作用（x±s）Tab.1 Inhibitory effects of Liujunzi Decoctionon on the proliferation of esophageal cancer line EC9706（x±s）

以下實驗只以藥物 IC50為用藥劑量：500 μg/mL

3.2 食管鱗癌EC9706細胞六君子湯條件培養(yǎng)基對CAM血管生成的影響 與空白對照組相比，腫瘤條件培養(yǎng)基明顯增加CAM血管面積，而500 μg/mL六君子湯條件培養(yǎng)基可以明顯減少血管生成，和腫瘤條件培養(yǎng)基比，有顯著差異，結果見表2。

表2 不同組別對CAM血管生成的影響（x±s）Tab.2 Effect of d ifferent groups on CAM angiogenesis（x±s）

3.3 人食管鱗癌EC9706細胞六君子湯條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內皮細胞株HUVECS增殖的抑制作用 空白對照組、六君子湯條件培養(yǎng)基組A值明顯低于與腫瘤條件培養(yǎng)基組 （P＜0.05），六君子湯條件培養(yǎng)基組A值低于空白對照組 （P＜0.05）。結果見表3。

表3 不同組別對人臍靜脈內皮細胞株HUVECS增殖的影響（n=4，x±s）Tab.3 Effect of different groups on the proliferation of hum an umbilical vein endothelial cell HUVECS（n=4，x±s）

3.4 人食管鱗癌EC9706細胞六君子湯條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內皮細胞株HUVECS遷移的抑制作用 各組HUVECS細胞于Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤條件培養(yǎng)基組的細胞遷移量較空白對照組有明顯的增加 （P＜0.05），六君子湯條件培養(yǎng)組的細胞遷移量較腫瘤條件培養(yǎng)基組有輕微的抑制作用（P＜0.05）。結果見表4。

表4 不同組別對人臍靜脈內皮細胞株HUVECS遷移的影響 （x±s）Tab.4 Effect of different groups on themigration of human umbilical vein endothelial cell HUVECS（x±s）

3.5 人食管鱗癌EC9706細胞六君子湯條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內皮細胞株HUVECS小管形成的抑制作用 空白對照組小管形成個數(shù)明顯低與腫瘤條件培養(yǎng)基組，兩者相比有顯著統(tǒng)計學差異 （P＜0.01）；六君子湯條件培養(yǎng)基組明顯低于腫瘤條件培養(yǎng)基組 （P＜0.01），見表5。

表5 不同組別對人臍靜脈內皮細胞株HUVECS小管形成的影響 （x±s）Tab.5 Effect of different groups on the tube formation of hum an um bilical vein endothelial cell HUVECS（x±s）

3.6 不同質量濃度六君子湯對EC9706細胞和人臍靜脈內皮細胞株HUVECS分泌VEGF和IL-6的影響 見表6。

表6 六君子湯對EC9706和HUVECS細胞分泌VEGF和IL-6的影響（n=3，x±s）Tab.6 E ffects of different groups on the VEGF and IL-6 secretion of EC9706 and HUVECS cells（n=3，x±s）

4 討論

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，我國每年約有25萬新診斷的食管癌病例，占全世界食管癌病例數(shù)的一半，預后較差，五年生存率不到15%［6］。研究發(fā)現(xiàn)，食管癌腫瘤微血管密度 （MVD）值與腫瘤侵襲和轉移呈正相關，與生存時間呈負相關［7］，因此本實驗圍繞食管癌細胞EC9706致血管生成對六君子湯進行了研究。

首先，本實驗從腫瘤細胞增殖角度著手，發(fā)現(xiàn)六君子湯不同質量濃度作用48 h后可以明顯抑制EC9706細胞增殖，且隨藥物濃度的增加而升高，呈劑量-效應依賴關系。與文獻［3］相比，雖然藥物提取方法不同，結果趨勢一致，說明六君子湯水溶成分和醇溶成分都有一定抑制食管癌增殖作用。值得一提是，用以溶解醇提物的溶劑DMSO在大于1%時對細胞增殖有一定影響［8］（預實驗，結果未顯示），因此本研究在做細胞抑制試驗時分別用含有和用藥組等劑量DMSO完全培養(yǎng)基做對照組；但是在條件培養(yǎng)基制備時，由于DMSO含量為0.5%，對細胞沒有影響，因此對照組所用為完全培養(yǎng)基。

腫瘤引起血管生成依賴于腫瘤細胞產(chǎn)生的各種生長因子及調控血管周圍環(huán)境和內皮細胞增殖、遷移的各類分子，如VEGF、bFGF、IL-6、MMP-9等［9］。為了研究EC9706細胞所產(chǎn)生分子對血管生成的影響，制備了EC9706細胞條件培養(yǎng)基，并進行以下實驗。

雞胚絨毛尿囊膜模型 （CAM）是常用的血管生成實驗體內模型［10］，本實驗觀察到EC9706細胞條件培養(yǎng)基可顯著增加CAM生成的血管總面積，而用六君子湯干預后的EC9706細胞條件培養(yǎng)基可減少CAM血管生成，說明六君子湯可以通過抑制EC9706細胞釋放某些促進血管生成的分子。

血管生成過程包括機制降解、內皮細胞增殖、遷移、血管形態(tài)形成［11］。為了進一步研究六君子湯作用機制，本實驗發(fā)現(xiàn)EC9706細胞條件培養(yǎng)基可以顯著增加人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移和小管形成，而用六君子湯干預后的條件培養(yǎng)基，內皮細胞的這些生物行為明顯減弱，說明六君子湯可抑制EC9706細胞分泌的分子效應是多方面。

由于VEGF和IL-6表達和食管癌的浸潤、轉移及預后密切相關，并在血管生成過程中發(fā)揮重要作用［12-13］，本實驗對六君子湯對EC9706細胞和臍靜脈內皮細胞分泌此兩個分子影響進行了觀察，發(fā)現(xiàn)六君子湯雖然不能夠減少EC9706細胞分泌VEGF，但能顯著減少臍靜脈內皮細胞分泌該分子，并能減少兩類細胞分泌IL-6。由此可知，六君子湯對內皮細胞和EC9706細胞作用不同，其減少腫瘤和內皮細胞IL-6和VEGF分泌可能是它抑制腫瘤所致血管生成分子機制之一。

總之，六君子湯可抑制腫瘤所致內皮細胞增殖、遷移和小管形成，從而抑制血管生成，并可能通過對腫瘤和內皮細胞分泌VEGF和IL-6的干預發(fā)揮作用，但由于腫瘤所致血管生成分子機制復雜，六君子湯的作用分子機制需進一步研究。

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Effect of Liujunzi Decoction on angiogenesis of esophageal cancer cell line EC9706

ZHOU Ling， YIN Su-gai， WU Yao-song， WANG Hui-hui， CHEN Yu-long*
（Molecular Biological Experiment Center of Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China）

AIMTo study the effects of Liujunzi Decoction on the angiogenesis of esophageal cancer cell line EC9706.METHODSThe inhibitory effect of Liujunzi Decoction alcohol extract on proliferation of EC9706 was detected by MTT assay.500μg/mL of EC9706 cell conditioned media in Liujunzi Decoction was collected and used to observe the angiogenesis of chick embryo chorioallantoic membrane（CAM），proliferation migration and tube formation of human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）.VEGF and IL-6 level in culturemedium supernatantof EC9706 cells and HUVECSwere detected by ELISA.RESULTSLiujunziDecoction alcohol extract could inhibit the proliferation of EC9706 cellswith IC50 value of505.28μg/mL in a dose dependentmanner，and markedly reduce the elevation in the angiogenesis of CAM，HUVECs proliferation，migration and tube formation caused by EC9706 cell conditioned medium.It also decreased both IL-6 level from EC9706 and HUVECs and VEGF level from HUVECs in serum.CONCLUSIONLiujunzi Decoction alcohol extract can inhibit the angiogenesis through intervening secretion of EC9706 cell signal pathway.

Liujunzi Decoction；esophageal cancer cell line EC9706；human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）；chicken embryo chorioallantoic membrane（CAM）；angiogenesis；VEGF；IL-6

R285.5

：A

：1001-1528（2015）06-1165-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.003

2014-08-18

國家自然科學基金資助項目 （81173177）；河南省教育廳科學自然基金項目 （2010B36004）；鄭州市科技局項目（10PTGS486-10）

周 凌 （1988—），女，碩士，研究方向為腫瘤的病機與防治。Tel：（0371）56676982

*通信作者：陳玉龍 （1973—），男，博士，教授，研究方向為腫瘤的病機與防治。Tel：（0371）65680206，E-mail：cyl72621@ 163.com