顧青青， 邵以諾， 安 叡， 王 躍， 張藝竹， 王新宏

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

葛根芩連湯有效成分對(duì)黃芩苷在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

顧青青， 邵以諾#， 安 叡*， 王 躍， 張藝竹， 王新宏

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

目的采用LC-MS/MS法研究葛根芩連湯（葛根、黃芩、黃連、甘草）有效成分對(duì)黃芩苷在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。方法建立Caco-2細(xì)胞模型，采用細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP2）的功能。結(jié)果攝取實(shí)驗(yàn)中，黃芩苷的攝取量在60min基本達(dá)到飽和 ［（0.68±0.07）ng/μg］，加入MRP2抑制劑MK-571之后，黃芩苷的攝取量顯著升高 ［（1.10±0.02）ng/μg，P＜0.01］，而P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米無此效果。配伍葛根素能提高黃芩苷的攝取量 （P＜0.05），而小檗堿、甘草苷的作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，加入MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑后能增加黃芩苷從腸腔側(cè) （AP）到基底側(cè) （BL）側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)。配伍葛根素、甘草苷后能促進(jìn)黃芩苷從AP到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，小檗堿無明顯影響。結(jié)論MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控Caco-2細(xì)胞攝取吸收黃芩苷，推測(cè)其可能為MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物。葛根素可使在Caco-2細(xì)胞中黃芩苷被外排的量減少，從而增加黃芩苷的吸收量。

葛根芩連湯；Caco-2；轉(zhuǎn)運(yùn)；多藥耐藥相關(guān)蛋白 （MRP2）；黃芩苷；葛根素；甘草苷；小檗堿

KEY WORDS：Gegen Qinlian Decoction；Caco-2 cells；transport；multidrug resistance-associated protein 2（MRP2）；baicalin；puerarin；liquiritin；berberine

葛根芩連湯記載于張仲景的 《傷寒論·太陽(yáng)病上篇》，全方有清泄里熱，解肌散邪之功效，由葛根、黃芩、黃連、甘草四味藥組成，黃酮、生物堿是其主要的藥理活性成分［1］。葛根芩連湯經(jīng)口服給藥，其有效成分必先經(jīng)過腸道的吸收才能進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥效。

Caco-2（Mancolon carcinoma cell lines）細(xì)胞模型來源于人類結(jié)腸癌細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和生化特性類似于人小腸上皮細(xì)胞，已作為公認(rèn)的研究藥物腸吸收機(jī)制的有效工具之一，且能預(yù)測(cè)藥物體內(nèi)吸收、代謝和藥物相互作用［2］。藥物在吸收、分布、排泄過程中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)均受到藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響，目前研究比較多的是P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2），其利用ATP分解產(chǎn)生的能量將細(xì)胞內(nèi)的藥物外排，起著外向型轉(zhuǎn)運(yùn)泵作用，在藥物的吸收中起著重要的作用［3］。Caco-2細(xì)胞能夠表達(dá)MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且在一定培養(yǎng)條件下，Caco-2細(xì)胞模型穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。

黃芩苷是中藥黃芩中的主要活性成分，有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性。有文獻(xiàn)報(bào)道［4-5］，黃芩苷在腸道中的吸收受MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控。課題組前期研究表明，在葛根芩連湯全方中的黃芩苷的吸收要好于其他配伍組［6］，且葛根的作用強(qiáng)于甘草［7］，為了推測(cè)葛根芩連湯中某些成分可能起到類似MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的作用，通過抑制MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)黃芩苷的外排作用，使黃芩苷的吸收增加。本研究運(yùn)用LC-MS/MS法，研究葛根芩連湯有效成分對(duì)黃芩苷在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，并采用Caco-2細(xì)胞模型研究葛根芩連湯中黃芩苷及其他活性成分同MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的關(guān)系，希冀從MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的角度闡釋復(fù)方配伍的規(guī)律。

1 材料

1.1 藥物與試劑 葛根素 （批號(hào) 110752-200912）、黃芩苷 （批號(hào)110715-201117）、鹽酸小檗堿 （批號(hào) 110713-201212）、甘草苷 （批號(hào)111610-201106）、鹽酸維拉帕米 （批號(hào)100223-200102）、卡馬西平 （批號(hào)100142-201105）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；DMEM高糖培養(yǎng)液（Hyclone，美國(guó)）；胎牛血清（Hyclone，美國(guó)）；非必需氨基酸，青霉素-鏈霉素雙抗液 （Gibco公司，美國(guó)），胰蛋白酶Trypsin-EDTA（Gibco，美國(guó)）；MTT，MK-571（Sigma公司，美國(guó)）；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 （碧云天生物技術(shù)研究所）；HBSS緩沖液（Hanks Balanced Salt Solutions，Gibco by life technologies，美國(guó)）、PBS緩沖液（Phosphate Buffered Saline，上海康穩(wěn)生物科技有限公司）；水為超純水；其他試劑為分析純。

1.2 儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Binder，德國(guó)）；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州安泰技術(shù)有限公司）；Millicell-ERS跨膜電阻儀（Millipore，美國(guó)）；倒置光學(xué)顯微鏡 （Nikon，日本）；高速冷凍離心機(jī) （Eppendorf Centrifuge5424R，德國(guó)）；AL104電子天平 （梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；酶標(biāo)儀（Synery HY，美國(guó)）；Agilent1290液相色譜儀（Agilent，美國(guó)），Agilent 6460 Triple Quad LC/MS三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（Agilent，美國(guó)）等。

1.3 細(xì)胞株 Caco-2細(xì)胞株購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心（原代來源于ATCC：American type culture collection），本研究過程中所有使用的Caco-2細(xì)胞均在25～35代之間。

2 方法

2.1 溶液的配置 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液配制：分別取黃芩苷、葛根素、鹽酸小檗堿、甘草苷、鹽酸維拉帕米、MK-571適量，精密稱定，用 （DMSO）溶解，并用HBSS緩沖液溶解配置成質(zhì)量濃度分別為223、208、185、209、1 140、643μg/m L的對(duì)照品貯備液，備用。使用時(shí)用HBSS緩沖液稀釋至所需濃度，并使DMSO濃度低于0.1%。

給藥溶液配制：分別取上述不同標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配成下述不同配伍組給藥溶液，20μmol/L的黃芩苷溶液，20μmol/L的黃芩苷和20μmol/L的葛根素溶液，20μmol/L的黃芩苷和20μmol/L的小檗堿溶液，20μmol/L的黃芩苷和20μmol/L的甘草苷溶液，20μmol/L的黃芩苷和100μmol/L的維拉帕米溶液，20μmol/L的黃芩苷和50μmol/L的MK-571溶液。

細(xì)胞培養(yǎng)液的配置：無菌的DMEM高糖培養(yǎng)液中加入胎牛血清、非必需氨基酸、青霉素-鏈霉素雙抗液，所占比分別為10%、1%、1%，混合均勻，即得，4℃冷藏備用。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120EC-C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，2.7-Micron）；流動(dòng)相水（A）-甲醇（B）梯度洗脫（0 min～2.5 min，B：50% ～95%；2.5 min～4 min，B：95% ～95%；體積流量0.3 m L/min，柱溫室溫，進(jìn)樣量5μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜儀采用大氣壓電噴霧電離源 （ESI），干燥氣溫度設(shè)定為350℃，干燥氣體積流量為10 L/min，霧化器壓力為275.8 kPa，毛細(xì)管電壓為4 000 V。選擇正離子掃描方式，多反應(yīng)檢測(cè)模式 （MRM）測(cè)定。其他參數(shù)如表1所示。

表1 質(zhì)譜選擇通道及相關(guān)參數(shù)Tab.1 M ass spectrometry ionization channels and relevant param eters

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 將黃芩苷和卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品用五氧化二磷干燥48 h，取適量，精密稱定，用甲醇溶解，得1.12μg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液，0.983μg/mL的卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 樣品處理 將取得的細(xì)胞樣品加入等體積的乙腈，渦旋混勻，高速離心，取上清液過膜后按“2.2.2”項(xiàng)下確定的質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

2.3 Caco-2細(xì)胞模型的建立 按文獻(xiàn)［8］方法，將購(gòu)買的細(xì)胞株加入胰蛋白酶消化，低速離心除去殘留胰酶后接種至3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入DMEM高糖培養(yǎng)液 （含10%牛血清、1%抗溶液、1%需氨基酸溶液），放入5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) （37℃恒溫），隔天吸走所有培養(yǎng)液，更換新鮮的培養(yǎng)液。6～7 d后，在倒置顯微鏡中觀察，如果達(dá)到80% ～90%融合時(shí)，使用胰酶消化，按照一定比例，或繼續(xù)傳代培養(yǎng)，或進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞在25～35代之間。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn) 取Caco-2細(xì)胞，加入胰酶消化，1 500 r/min低速離心5 min，上清液棄去。加入2 mL培養(yǎng)液，用移液器輕輕吹打，將細(xì)胞分散均勻。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器將細(xì)胞混懸液計(jì)數(shù)，然后將其稀釋到1×105個(gè)/mL，按每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板上。將接種好細(xì)胞的96孔板放入5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后，分別更換含有不同濃

2.5 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 取Caco-2細(xì)胞，加入胰酶消化，1 500 r/min低速離心5 min，上清液棄去。加入2 mL培養(yǎng)液，將細(xì)胞分散均勻。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器將細(xì)胞混懸液計(jì)數(shù)，然后將其稀釋到1×105個(gè)/m L，將稀釋的細(xì)胞混懸液接種到24孔板上，每孔1 mL。隔天更換新鮮的培養(yǎng)液，6～7 d，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞達(dá)到100%融合后進(jìn)行攝取實(shí)驗(yàn)。用PBS緩沖液將細(xì)胞洗滌3次，洗去剩余的培養(yǎng)液。然后加入1 mL含有不同濃度黃芩苷的培養(yǎng)液，作用一段時(shí)間后，吸去所有的藥液，加入1 mL PBS緩沖液，清洗殘余的藥液。最后加入1 m L的超純水，-80℃反復(fù)凍融3次，超聲30 min，以破碎細(xì)胞?；靹蚝笕〖?xì)胞懸液，15 000 r/min，4℃冷凍離心15 min，并取上清液5μL進(jìn)樣分析，按 “2.2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)黃芩苷的含量。未過濾細(xì)胞懸液以考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白［9］。

細(xì)胞攝取量的計(jì)算公式為：度的藥液，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，即接種細(xì)胞后加空白培養(yǎng)液；調(diào)零組，即不接種細(xì)胞只加入空白培養(yǎng)液。將加好藥液的96孔板放入5%CO2培養(yǎng)箱中。24 h后取出，每孔加入MTT溶液20μL，繼續(xù)放入5%CO2培養(yǎng)箱，4 h后反應(yīng)完全，移去所有液體，每孔加入DMSO溶液150μL，振蕩2 min，使形成的紫色結(jié)晶充分溶解，MTT實(shí)驗(yàn)樣品直接使用酶標(biāo)儀在495 nm處檢測(cè)其光吸收值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為：

2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 將Caco-2細(xì)胞用胰酶消化，低速離心除去殘留的胰酶。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞混懸液稀釋到5×105個(gè)/m L，然后把細(xì)胞接種到Transwell 24培養(yǎng)板中的Millicell小室中。24孔培養(yǎng)板隔天換液，21 d后，用Millicell-ERS跨膜電阻儀檢測(cè)跨膜電阻，跨膜電阻值大于 500 Ω·cm2，則可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

首先用HBSS緩沖液將細(xì)胞洗滌3次，最后加入HBSS緩沖液，然后將24孔培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，除去所有的HBSS緩沖液。取400μL溶有不同配伍組的藥液，加入Transwell 24培養(yǎng)板的Apical（腸腔側(cè)，AP）或Basolateral（基底側(cè)，BL）作供給池，其對(duì)應(yīng)的BL側(cè)或AP側(cè)加入600μL空白HBSS緩沖液作為接收池，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于給藥后15、30、45、60、90、120 min時(shí)，從接收池取樣各100μL，同時(shí)補(bǔ)足同體積預(yù)熱至37℃空白HBSS緩沖液。實(shí)驗(yàn)平行做3組。

將細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的樣品溶液加入等體積乙腈，渦旋混勻，15 000 r/min，并取5μL上清液進(jìn)樣分析，按 “2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)黃芩苷的含量。

2.7 參數(shù)的計(jì)算

2.7.1 表觀滲透系數(shù) 藥物的表觀滲透系數(shù)（apparent permeability）Papp代表藥物轉(zhuǎn)運(yùn)能力的大小。它的計(jì)算公式為：

Papp=（dQ/dt）（1/S）（1/C0）

其中，Q表示累計(jì)轉(zhuǎn)運(yùn)量，表示dQ/dt累計(jì)轉(zhuǎn)運(yùn)量和時(shí)間曲線的斜率，S是轉(zhuǎn)運(yùn)膜的面積（0.6 cm2），C0是藥物的初始濃度，Papp的單位常用為cm/h或cm/s；Papp（BL-AP）是藥物BL側(cè)到AP側(cè)的分泌表觀滲透系數(shù)，Papp（AP-BL）是藥物從AP側(cè)倒BL側(cè)的吸收表觀滲透系數(shù)。

2.7.2 外排比率 藥物外排率［10］（Efflux Ratio，ER）用Papp（BL-AP）與Papp（AP-BL）的比值表示，代表藥物凈往外排的能力，預(yù)測(cè)外排作用引起的藥物口服吸收減弱的程度。公式如下：

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用One-way ANOAY方差分析，各組間數(shù)據(jù)比較采用LSD、S-N-K檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)以表示。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1、圖2，各配伍組的細(xì)胞存活率均在95%以上，光學(xué)顯微鏡下觀察，各配伍組細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)完好，未見明顯損傷，表明建立的Caco-2細(xì)胞模型穩(wěn)定可靠，在預(yù)給藥濃度下，成分之間的配伍不會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生顯著性損傷。

圖1 黃芩苷及其各配伍組的細(xì)胞存活率Fig.1 Cell viability of baicalin and its com patibility groups

圖2 光學(xué)顯微鏡下的不同組別的Caco-2細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Different groups of morphology under opticalm icroscope in Caco-2 cell

3.2 方法學(xué)研究

3.2.1 色譜條件 在 “2.2.2”項(xiàng)條件檢測(cè)下，分別進(jìn)樣空白HBSS溶液，對(duì)照品溶液，樣品溶液，結(jié)果表明，黃芩苷的檢測(cè)靈敏度高，且溶液中無雜質(zhì)峰干擾樣品的測(cè)定，見圖3。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取不同體積的黃芩苷對(duì)照貯備液，用HBSS緩沖液稀釋，使其質(zhì)量濃度分別為0.056、0.112、0.280、0.560、0.840 μg/mL，取系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液各200μL，加入20μL卡馬西平溶液 （0.983μg/m L），取5μL進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，黃芩苷的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到黃芩苷在0.056～1.12μg/mL線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：Y=0.000 8X+0.130 1，r=0.999 6。

3.2.3 精密度試驗(yàn) 精密移取對(duì)照品溶液，加入內(nèi)標(biāo)，混勻后重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，計(jì)算峰面積 （Ai）與內(nèi)標(biāo)峰面積 （A s）比值Y，結(jié)果表明，黃芩苷Y值的RSD值為1.3%，符合測(cè)定要求。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液，加入內(nèi)標(biāo)，混勻后分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得峰面積，計(jì)算峰面積 （Ai）與內(nèi)標(biāo)峰面積（A s）比值Y，結(jié)果表明，黃芩苷Y值的RSD值為

圖3 專屬性實(shí)驗(yàn)LC-MS/MS色譜圖Fig.3 LC-MS/MS chrom atogram s of the specificity tests

5.1%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 回收率試驗(yàn) 取已知濃度的樣品溶液，分別加入低、中、高3種濃度的對(duì)照品溶液適量，按“2.2.4”項(xiàng)下的方法處理，每200μL樣品加入20μL卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液，按確定的質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算各組平均回收率，結(jié)果顯示，平均回收率為99.5%，符合測(cè)定要求。

3.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果 黃芩苷在黃芩苷組、黃芩苷和MK571配伍組、黃芩苷和維拉帕米配伍組、黃芩苷和葛根素配伍組、黃芩苷和小檗堿配伍組以及黃芩苷和甘草苷配伍組中的攝取量分別為（0.68±0.07）、 （1.10±0.02）、 （0.73±0.08）、（0.91±0.04）、 （0.84±0.08）、 （0.73±0.04）ng/μg。同黃芩苷組相比，加入P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米的配伍組未能提高黃芩苷的攝取量，而加入MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑MK-571能夠顯著增加黃芩苷的攝取量 （P＜0.05），初步證實(shí)黃芩苷是MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物。葛根素、小檗堿能夠提高黃芩苷在Caco-2細(xì)胞中攝取量，其中葛根素有顯著性差異 （P＜0.05）見圖4。

圖4 黃芩苷在不同物質(zhì)的作用下的攝取量Fig.4 Baicalin intake in differentmaterial actions

3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （圖5）所示，所有組別中黃芩苷的Papp（BL-AP）值之間無顯著性差異，表明黃芩苷的外排量具有一定的飽和性和方向性，這與Teruaki Akao［11］等人研究黃芩苷在Caco-2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌依靠MRP2的作用相關(guān)，且主要在 AP側(cè)。各組黃芩苷的Papp（AP-BL）值分別為［（0.53±0.05）、 （1.55± 0.07）、 （0.61±0.08）、 （1.04±0.14）、 （0.66± 0.10）、（0.93±0.07）］×10-6cm/s，MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑MK-571能夠顯著性增加黃芩苷的Papp（AP-BL）值，而P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米對(duì)黃芩苷Papp（AP-BL）值的增加無顯著性影響，推測(cè)黃芩苷在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)可能未涉及P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排作用。葛根素和甘草苷均能提高黃芩苷Papp（AP-BL）的值 （P＜0.05），推測(cè)葛根素、甘草苷可能為MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，可促進(jìn)黃芩苷的吸收。

圖5 黃芩苷在不同配伍組中的Papp值Fig.5 Papp values of baicalin in different compatibility groups

表2 黃芩苷在不同組別中的ER值Tab.2 ER value of baicalin in d ifferent groups

表2 黃芩苷在不同組別中的ER值Tab.2 ER value of baicalin in d ifferent groups

注：與黃芩苷組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；ER值為Papp（BL-AP）與Papp（AP-BL）的比

組別P app（AP-BL）/（×10-6cm·s-1） ER值P app（BL-AP）/（×10-6cm·s-1）0.53±0.05 0.86±0.39 1.62黃芩苷+MK-571 1.54±0.06** 0.84±0.53 0.55黃芩苷+維拉帕米 0.60±0.07 0.87±0.04 1.43黃芩苷+葛根素 1.04±0.13* 0.81±0.10 0.78黃芩苷+小檗堿 0.65±0.09 0.89±0.06 1.36黃芩苷+甘草苷 0.93±0.06*黃芩苷0.85±0.09 0.92

本研究各組的ER值如表2所示，分別為1.62、0.55、1.43、0.78、1.36、0.92。在MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑MK-571的作用下，黃芩苷在Caco-2細(xì)胞中的ER值能夠從1.62降低到0.55，降低幅度大于50%，葛根素配伍組降低程度與MK-571配伍組類似，這兩個(gè)配伍組與黃芩苷組相比，均有顯著性差異，其他配伍組降低程度不明顯。

4 討論

本研究建立的黃芩苷成分的LC-MS/MS分析方法，可實(shí)現(xiàn)組分的高效，快速檢測(cè)。方法學(xué)考察表明該檢測(cè)方法可用于Caco-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)樣品中黃芩苷含量的測(cè)定，精密度、穩(wěn)定性可靠，可為葛根芩連湯腸吸收特征的研究提供可靠、高效的分析方法。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明建立的Caco-2細(xì)胞模型穩(wěn)定可靠，在預(yù)給藥濃度下，成分之間的配伍不會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生顯著性損傷。光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，無明顯裂隙。

攝取實(shí)驗(yàn)中，黃芩苷的攝取量在60 min基本達(dá)到飽和，加入MRP2抑制劑MK-571之后，黃芩苷的攝取量顯著升高（P＜0.01），而P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米無此效果。初步說明黃芩苷能被Caco-2細(xì)胞攝取，是MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物，黃芩苷在Caco-2細(xì)胞上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)受到MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控。配伍其他成分后，葛根素能提高黃芩苷的攝取量 （P＜0.05）。

細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，加入MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑后能增加黃芩苷從AP到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)。配伍葛根素、甘草苷后能促進(jìn)黃芩苷從AP到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，小檗堿無明顯影響。綜合攝取實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測(cè)，黃芩苷為MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物，其吸收受MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控。葛根素能夠抑制MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)黃芩苷的外排作用，使黃芩苷被Caco-2細(xì)胞外排的量減少，黃芩苷吸收量增加。研究結(jié)果從MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白角度初步闡明了課題組前期研究結(jié)果，即在葛根芩連湯全方中的黃芩苷的吸收要好于其他配伍組，葛根促進(jìn)其吸收的作用較強(qiáng)的機(jī)理。

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Influence of active ingredients in Gegen Qinlian Decoction on uptake and transport of baicalin in Caco-2 cellm odel

GU Qing-qing， SHAO Yi-nuo#， AN Rui*， WANG Yue， ZHANG Yi-Zhu， WANG Xin-hong

（Shanghai University of TCM，Shanghai201203，China）

AIMTo study the influence of the active ingredients in Gegen Qinlian Decoction（Puerariae lobatae Radix，Scutellariae Radix，CoptidisRhizoma，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）on the transporting properties of baicalin across Caco-2 cellmodel with LC-MS/MS.METHODSThe established Caco-2 cellmodel was employed to evaluate the functionsofmultidrug resistance-associated protein 2（MRP2）by cell uptake and cell transport experiments.RESULTSThe results of cell uptake experiments showed that the saturated uptake of baicalin could reach（0.68±0.07）ng/μg in 60 min.MRP2 inhibitor MK-571 could enhance the uptake of baicalin up to（1.10±0.02）ng/μg（P＜0.01），while P-gp inhibitor Verapamil did not have similar effect.After the compatibility experiments，puerarin increased the uptake of baicalin（P＜0.05），whereas liquiritin was not of statistical significance.The cell transfer experiment indicated the addition of MRP2 inhibitor could increase the transport of baicalin from apical side to basolateral side.The combination of puerarin and liquiritin enhanced the transport of baicalin from apicalside to basolateral side，butberberine presented no effect.CONCLUTIONWe could speculate that baicalinmightbe MRP2 transporter substrate in Caco-2 cell based on the experiment data and the fact that MRP2 transporter increases the absorption of baicalin.Puerarin can decrease the efflux of baicalin from the Caco-2 cells，thus increasing its uptake.

R85.5

A

1001-1528（2015）04-0694-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.001

2014-04-15

顧青青 （1989—），女，碩士生，研究方向?yàn)樗幬锓治雠c體內(nèi)過程研究。Tel：（021）51322450，E-mail：gqq19890428qq@ 126.com

#邵以諾：共同第一作者

*通信作者：安 叡 （1973—），女，博士，副教授，研究方向?yàn)樗幬锓治雠c體內(nèi)過程研究。Tel：（021）51322183，E-mail：anruimw @126.com