梁 春， 郭建明， 段金廒， 黃 婧， 劉 培， 錢大瑋

（南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心中藥資源產(chǎn)業(yè)與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇南京210023）

歸芷軟膠囊治療黃褐斑的實驗研究

梁 春， 郭建明， 段金廒*， 黃 婧， 劉 培， 錢大瑋

（南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心中藥資源產(chǎn)業(yè)與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇南京210023）

目的觀察歸芷軟膠囊 （白芷、當(dāng)歸、珍珠粉、銀杏葉等）對黃褐斑模型小鼠肝臟和皮膚中酪氨酸酶水平、超氧化物歧化酶 （SOD）活力、丙二醛水平、皮膚中黑色素細(xì)胞免疫組化的影響。方法60只SPF級雌性ICR小鼠隨機(jī)均分成空白組，模型組，VC片組，歸芷軟膠囊低、中、高劑量，除空白組外各組接受中波紫外線照射加肌肉注射黃體酮誘發(fā)黃褐斑。測定各組小鼠肝臟和皮膚中的酪氨酸酶和丙二醛的水平，SOD活力，同時采用免疫組化法觀察小鼠皮膚中Melan A的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，歸芷軟膠囊低、中、高劑量組肝臟和皮膚中酪氨酸酶和丙二醛水平，皮膚中黑色素細(xì)胞的陽性目標(biāo)面積、平均直徑、積分光密度明顯降低，有顯著性差異 （P＜0.01或P＜0.05）；陽性對照組維生素C片組小鼠皮膚中SOD活力明顯升高，有顯著差異 （P＜0.05），其它組沒有顯著性差異。結(jié)論歸芷軟膠囊對黃褐斑模型小鼠有一定的防治作用。其機(jī)制可能與抑制酪氨酸酶活性和黑色素細(xì)胞的增殖，提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

歸芷軟膠囊；黃褐斑；酪氨酸酶；超氧化物歧化酶；丙二醛；黑色素

黃褐斑是一種面部色素代謝障礙的損容性皮膚病。在祖國醫(yī)學(xué)古籍文獻(xiàn)中記載為 “肝斑”、 “黧黑斑”。好發(fā)于面部，形狀為不規(guī)則的淡褐色或黃褐色斑片，常對稱分布于眼眶、兩頰、額部、口角等處，邊界較清，形似蝴蝶；伴有月經(jīng)量少、痛經(jīng)、睡眠不佳等癥狀，病程纏綿，易診難治等；給黃褐斑患者帶來了生理、心理、精神等諸多方面的煩惱和痛苦。本研究歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠肝臟、皮膚中酪氨酸酶 （TYR）水平，超氧化物歧化酶（SOD）活性，丙二醛 （MDA）水平，皮膚中黑色素細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化的影響，為開發(fā)治療黃褐斑藥物提供依據(jù)。

黃褐斑的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，可能的相關(guān)因素也較多，不過迄今為止研究者較普遍認(rèn)可的說法是：人體內(nèi)分泌紊亂、紫外線照射、遺傳等因素是導(dǎo)致黃褐斑生成的主要因素［1］；而中醫(yī)則認(rèn)為人體是一個有機(jī)整體，黃褐斑雖然是一種發(fā)生在面部的疾病，但多因臟腑功能失調(diào)，氣血不營，脈絡(luò)不暢，瘀而成斑為主，與肝、脾、腎三臟有關(guān)，尤其與肝臟關(guān)系最為緊密，而血瘀貫穿始終［2］。歷代醫(yī)家對此病的治療雖有不同，但都遵循辨證論治的原則。

歸芷軟膠囊處方來源為自擬方，是根據(jù)黃褐斑發(fā)病病因及發(fā)病機(jī)制，選取具有養(yǎng)血活血、祛斑化瘀、美容養(yǎng)顏、補(bǔ)血消斑功效的中藥組成的復(fù)方。方由白芷、當(dāng)歸、珍珠粉、銀杏葉提取物等六味藥組成。方中白芷具有祛風(fēng)燥濕、消腫排膿、生肌止痛之功，能 “長肌膚、潤澤顏色，可做面脂”；當(dāng)歸是補(bǔ)血之圣品，具有質(zhì)潤澤膚、養(yǎng)血活血、補(bǔ)血生肌的作用；珍珠具有安神定驚、潤膚祛斑、解毒生肌的功效；銀杏葉提取物具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂的活性。諸藥合用，可共奏活血通脈，補(bǔ)血養(yǎng)顏，祛瘀消斑的功效。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 冰乙酸 （體積分?jǐn)?shù)≥99.5%）、無水乙醇 （體積分?jǐn)?shù)≥99.7%） （南京化學(xué)試劑有限公司）；甲醛 （體積分?jǐn)?shù)為 37% ～40%）（西隴化工股份有限公司）；氯化鈉 （上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；Anti-Melan A抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；ElivisionTMsuper免疫組化檢測試劑盒 （福建邁新生物技術(shù)有限公司）；PBS緩沖液（自制）：每升中含8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，pH調(diào)至7.4。其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

蛋白定量測試盒 （考馬斯亮藍(lán)法，批號140605）、 丙 二 醛 （MDA） 試 劑 盒 （批 號140603）、超氧化物歧化酶 （SOD）測定試劑盒（批號140621）（均購自南京建成生物工程有限公司）；酪氨酸酶 （TYR）測定試劑盒 （由南京建成生物工程有限公司代購）。

黃體酮注射液：每支20 mg/m L（批號130711），購自上海通用藥業(yè)股份有限公司，使用前用滅菌注射用水稀釋至所需濃度；維生素C片每片0.1 g（批號130505），購自東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司；滅菌注射用水每支5 m L（批號120605），購自江蘇方強(qiáng)制藥廠有限責(zé)任公司。

歸芷軟膠囊 （自制，以下簡稱歸芷），主要由當(dāng)歸、白芷、銀杏葉提取物、珍珠粉等六味組成。當(dāng)歸、白芷醇提物、銀杏葉提取物、珍珠粉等，按處方比例制備成軟膠囊內(nèi)容物。

1.2 實驗動物 SPF級ICR小鼠，60只，體質(zhì)量（20±2）g，均為雌性，由上海杰思捷實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0006。

動物飼養(yǎng)條件：60只小鼠分籠飼養(yǎng)。在自然條件相同的情況下，常規(guī)飼養(yǎng)，保持自然光照，無不良因素影響，飼養(yǎng)6 d適應(yīng)實驗環(huán)境后開始進(jìn)行實驗。

1.3 主要儀器設(shè)備 Leica ASP300S全自動真空組織脫水機(jī)；Thermo包埋機(jī)，型號Histostar；Thermo手動切片機(jī)，型號Finesse E+；Shandon全自動染色機(jī)；OLYMPUS顯微鏡BX41；TDL-80-2B型低速臺式離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）；SPX-150BⅢ型生化培養(yǎng)箱 （天津市泰斯特儀器有限公司）；Mettler Toledo型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器 （江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠）；Enspire multimode plate reader檢測儀（美國perkinelmer公司）；WH-1微型漩渦混合儀 （上海滬西分析儀器廠有限公司）；EPED-E2-30TF型實驗室級超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；紫外線照射燈，小鼠造?；\具 （自制），寵物剃毛器等。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制備

2.1.1 動物分組 取雌性ICR小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為空白組、模型組、陽性對照組、歸芷低劑量組、歸芷中劑量組及歸芷高劑量組。

2.1.2 動物模型制備 黃褐斑藥理動物模型的研究經(jīng)查閱文獻(xiàn) ［3-5］主要的動物模型有：雌激素（黃體酮）全身攻擊法、紫外線照射法等，但仍屬探索階段，至今尚無公認(rèn)可行的造模方法。實驗前期參考文獻(xiàn)，對雌激素全身攻擊法、紫外線照射法、紫外線照射輔助雌激素法進(jìn)行模型復(fù)制篩選，最終采用紫外照射輔助黃體酮注射液攻擊的方法進(jìn)行造模。

各組小鼠均用剃毛器除去背部短毛，用脫毛膏涂于小鼠背部（面積約3.0 cm×3.0 cm），2 min后用抹布擦干凈，實驗期間小鼠背部短毛長出者，應(yīng)立即除凈。除空白組外，其余5組實驗小鼠均放置在自制的造?；\具內(nèi)，以280～320 nm波長，每日照射小鼠背部皮膚1次，照射時間60 min，動物與光源的距離為20 cm，連續(xù)照射31 d；同時，空白組肌肉注射滅菌注射用水5 mL/kg，模型組及各給藥組肌肉注射黃體酮注射液20 mg/kg（相當(dāng)于人臨床等效劑量的8倍）。各組均注射于小鼠大腿根部，兩腿交替，連續(xù)31 d，并每天觀察其脫毛部位皮膚變化情況。

2.2 給藥方法 造模的同時開始按分組灌胃給藥，每天1次，連續(xù)31 d。每天下午①空白組，按10 mL/kg體質(zhì)量灌服生理鹽水；②模型組，同空白組；③歸芷低、中、高劑量組，按 3.05，6.1，12.2 g/kg體質(zhì)量灌服歸芷水溶液 （臨床等效劑量的3.5，7，14倍）；④陽性組，按0.1 g/kg體質(zhì)量灌服維生素C片水溶液 （相當(dāng)于人臨床等效劑量的10倍）。

2.3 取材及樣品制備

2.3.1 取材 治療30 d后，截止取材時，除去灌胃、自然死亡及造模死亡的小鼠，取材小鼠共54只，于取材前一天禁食不禁水12 h，末次給藥1 h后，小鼠脫頸椎處死，迅速取其肝臟和背部脫毛處全層皮膚 （不含皮下脂肪），用于生化指標(biāo)檢查。另外，取小鼠去毛皮膚1塊 （1.0 cm×1.0 cm），用于皮膚黑色素細(xì)胞的免疫組化檢測。

2.3.2 樣品制備 肝臟和皮膚樣本的制備 取肝臟和背部脫毛處全層皮膚，用預(yù)冷生理鹽水（4℃）沖洗，除凈血液和其他結(jié)締組織，用濾紙拭干；然后切取肝臟、皮膚各0.3 g，分別加入于樣本9倍量的預(yù)冷生理鹽水 （4℃），盡量剪碎組織，再倒入試管中，高速均漿，分別制成10%肝臟、皮膚組織勻漿液；再以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，分別制備肝臟和皮膚樣本，于-80℃冷凍保存。

免疫組化樣本制備 另取小鼠照射部位皮膚1塊（面積1.0 cm×1.0 cm），用10%甲醛固定皮膚，常規(guī)石蠟包埋切片，再經(jīng)脫蠟至水，抗原修復(fù)后，黑色素標(biāo)記采用免疫組織化技術(shù)，加Anti-Melan A抗體，采用免疫組化兩步法，DAB顯色，蘇木素復(fù)染等過程，用于小鼠皮膚黑色素細(xì)胞的免疫組化檢測［6-7］。

2.4 指標(biāo)測定

2.4.1 小鼠肝臟和皮膚指標(biāo)的測定 SOD活性、MDA水平的測定 取上述勻漿上清液，按試劑盒操作要求對各組小鼠的皮膚和肝臟進(jìn)行指標(biāo)測定，再按說明書公式計算SOD活性及MDA水平。

酪氨酸酶的測定 按照Elisa試劑盒的操作要求和步驟進(jìn)行測定，最后計算樣品酪氨酸酶濃度。

工作原理 本試劑盒應(yīng)用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）測定標(biāo)本中小鼠酪氨酸酶水平。樣品加入到預(yù)先包被了酪氨酸酶單克隆抗體的酶標(biāo)孔中，加入酪氨酸酶，溫育；溫育后，加抗酪氨酸酶抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，除去未結(jié)合的酶，加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺與樣品中小鼠酪氨酸酶的濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下，測量各孔的吸光度 （OD值）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中小鼠酪氨酸酶水平。

2.4.2 小鼠黑色素陽性目標(biāo)的計算機(jī)病理圖像分析 各組選取5只小鼠的皮膚組織塊，各制成1張病理切片，每張片隨機(jī)觀察5個互不重疊的視野，找到陽性目標(biāo) （皮膚表皮和附件上皮細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)棕色反應(yīng)）后，用計算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)軟件（Image-Pro?Plus5.0.2（IPP）軟件）對陽性目標(biāo)圖像進(jìn)行定量分析，得出每張切片5個視野及每組5只動物黑色素陽性目標(biāo)的目標(biāo)面積、平均直徑、積分光密度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件中的Descriptives進(jìn)行統(tǒng)計，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （）表示；與空白組和模型組比較，采用ANOVA中的Dunnett法進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異，兩者均表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 歸芷軟膠囊對黃褐斑模型小鼠肝臟及皮膚酪氨酸酶的影響 實驗結(jié)果表明，同空白組相比，模型組小鼠肝臟、皮膚中酪氨酸酶水平明顯增加，具有顯著性差異 （P＜0.05）；與模型組相比，維生素C片組，歸芷低、中、高3個劑量組的肝臟、皮膚中TYR水平明顯降低，有顯著性差異 （P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠模型肝臟及皮膚酪氨酸酶含量的影響 （，n=9）Tab.1 Impact of Guizhi Soft Capsules on tyrosinase contents in the liver and skin of chloasmamousem odel（，n=9）

表1 歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠模型肝臟及皮膚酪氨酸酶含量的影響 （，n=9）Tab.1 Impact of Guizhi Soft Capsules on tyrosinase contents in the liver and skin of chloasmamousem odel（，n=9）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 酪氨酸酶/（ng·mL-1）肝臟 皮膚空白組130.60±19.87 214.45±17.34模型組 162.69±12.57# 248.79±43.04#維生素C片組 132.32±26.45* 215.50±14.64*歸芷低劑量組 131.50±29.87* 196.49±22.95**歸芷中劑量組 135.23±25.97* 193.57±24.19**歸芷高劑量組 123.77±15.56** 208.31±43.24*

3.2 歸芷軟膠囊對黃褐斑模型小鼠肝臟及皮膚氧化指標(biāo)的影響 實驗結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)造模后，同空白組相比，模型組小鼠肝臟、皮膚中SOD活力明顯降低，MDA水平明顯增加，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。

與模型組相比，除維生素C片組小鼠皮膚中SOD活力明顯升高，具有顯著性差異 （P＜0.05）；其余給藥組皮膚、肝臟的SOD活力與模型組相比，沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但活力有升高的趨勢。

與模型組相比，除歸芷低劑量組皮膚有降低MDA水平的趨勢，沒有統(tǒng)計學(xué)差異外。其余給藥組肝臟、皮膚中的MDA水平均顯著降低，具有顯著性差異 （P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2、表3。

表2 歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠模型肝臟及皮膚中超氧化物歧化酶活力的影響 （，n=9）Tab.2 Im pact of Guizhi Soft Capsules on SOD activity in the liver and skin of chloasma mouse model（，n=9）

表2 歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠模型肝臟及皮膚中超氧化物歧化酶活力的影響 （，n=9）Tab.2 Im pact of Guizhi Soft Capsules on SOD activity in the liver and skin of chloasma mouse model（，n=9）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

肝臟 皮膚空白組組別 超氧化物歧化酶/（U·mgprot-1）108.17±11.80 528.36±60.94模型組 95.36±5.92# 426.68±22.74#維生素C片組 89.06±4.44 504.52±76.44*歸芷低劑量組 95.30±16.27 450.67±78.98歸芷中劑量組 97.19±11.63 430.30±63.00歸芷高劑量組97.20±7.43 459.54±103.19

表3 歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠模型肝臟及皮膚中丙二醛的影響（，n=9）Tab.3 Im pact of Guizhi Soft Capsules on malondialdehydelevel in the liver and skin of chloasma mouse model（，n=9）

表3 歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠模型肝臟及皮膚中丙二醛的影響（，n=9）Tab.3 Im pact of Guizhi Soft Capsules on malondialdehydelevel in the liver and skin of chloasma mouse model（，n=9）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05

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3.3 歸芷軟膠囊對黃褐斑模型小鼠皮膚黑色素細(xì)胞免疫學(xué)的影響 在前期模型篩選時，小鼠皮膚做了HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察黑色素細(xì)胞及黑色素在皮膚中的分布情況，但切片不能夠很清楚的看到黑色素，所以實驗中未選擇做HE染色，只做了黑色素免疫組化。

空白組：小鼠表皮中可見極少黑色素細(xì)胞，毛囊、皮脂腺基底細(xì)胞中見少量黑色素，胞漿著色棕褐色。以Anti-Melan A為陽性對照，黑色素細(xì)胞排列于基底層；模型組：黑色素主要存在小鼠皮膚真皮層，多見于汗腺、毛囊、皮脂腺，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層呈現(xiàn)深棕色。黃褐斑多表現(xiàn)為皮膚的黑色素沉著，分別給予維生素C片組和不同劑量的歸芷軟膠囊內(nèi)容物治療后，模型小鼠的皮膚黑色素得到明顯的改善；維生素C片組小鼠皮膚基底層黑色素數(shù)量較模型組有一定減少，呈棕褐色；與空白組相比，黑色素數(shù)量減少、深度變淺。尤其是中劑量組時，小鼠的皮膚黑色素大量減少，黑色素深度變淺。提示歸芷軟膠囊能顯著改善小鼠皮膚黑色素的形成，對黃褐斑具有一定的療效作用。結(jié)果見圖1。

光密度反映物體對光的吸收率 （透過率），反應(yīng)物體顏色的深淺程度；顏色越深，其對光線的吸收越多，故光密度越高。積分光密度顏色越深，面積越大，光密度越高。

實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠皮膚黑色素的陽性目標(biāo)的面積、平均直徑、積分光密度值明顯高于空白組，具有極顯著性差異 （P＜0.01）；與模型組相比，維生素C片組，歸芷低、中、高3個劑量組的皮膚黑色素的陽性目標(biāo)、平均直徑、積分光密度值明顯降低，有極顯著性差異 （P＜0.01），結(jié)果見表4。

圖1 歸芷軟膠囊對黃褐斑模型小鼠皮膚免疫組化形態(tài)Fig.1 Effect of Guizhi Soft Capsules on immunohistochem istry morphology of skin melasma mousem odel

表4 歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠模型皮膚的目標(biāo)面積、平均直徑、積分光密度的影響 （，n=5）Tab.4 Im pact of Guizhi Soft Capsules on the target area，mean diameter，and integrated optical density in the skin tissue of mouse model of skin melasma（，n=5）

表4 歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠模型皮膚的目標(biāo)面積、平均直徑、積分光密度的影響 （，n=5）Tab.4 Im pact of Guizhi Soft Capsules on the target area，mean diameter，and integrated optical density in the skin tissue of mouse model of skin melasma（，n=5）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

積分光密度空白組組別 面積/μm2 平均直徑/μm 222.92±36.34 13.06±0.92 74.12±12.42模型組 579.17±129.23##17.17±0.59## 178.28±38.95##維生素C片組 278.98±39.30** 13.41±0.49** 88.24±11.69**歸芷低劑量組 300.50±59.70** 13.94±1.13** 96.90±19.52**歸芷中劑量組 310.18±30.27** 15.31±0.91** 107.86±10.89**歸芷高劑量組 297.09±24.80** 14.28±0.52** 98.73±6.54**

4 討論

通過測定模型小鼠皮膚和肝臟的TYR水平、MDA水平、SOD活力及皮膚黑色素細(xì)胞免疫組化結(jié)果，確定本實驗方法建立黃褐斑小鼠模型是成功的。并且通過以上實驗數(shù)據(jù)顯示歸芷中劑量組（相當(dāng)于人臨床等效劑量的7倍）比歸芷低、高劑量組 （相當(dāng)于人臨床等效劑量的3.5，14倍）效果好。

當(dāng)皮膚受到外界環(huán)境的影響，如日光紫外的照射超過一定的程度，皮膚老化就成為一種必然，接著就會產(chǎn)生老年斑、黃褐斑等。但隨著崇尚綠色、回歸大自然的潮流興起，開發(fā)安全、高效而經(jīng)濟(jì)的新型抗衰老產(chǎn)品，已成為國內(nèi)外許多研究者重點關(guān)注的內(nèi)容；并且從天然中草藥中提取有效抑制黑色素的成分，如白芷提取物［8］、當(dāng)歸提取物［9］、銀杏葉提取物［10］，功效好，副作用小，且無過敏現(xiàn)象，具有無比的優(yōu)越性。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，酪氨酸酶是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于動植物和人體內(nèi)，在黑色素的形成過程中起著重要的作用，是黑色素代謝中的關(guān)鍵酶。皮膚黑色素的合成是酪氨酸在酪氨酸酶作用下與氧結(jié)合成為多巴，多巴又在酪氨酸酶的作用下再氧化失去兩個氫原子變?yōu)槎喟王缓笈c氧結(jié)合發(fā)生的一系列變化［11］。酪氨酸酶的活性決定著黑色素的合成及其量的多少，同時也是黑素細(xì)胞分化成熟的特征性標(biāo)志之一。很多補(bǔ)益、活血中藥多都具有抑制酪氨酸酶活性、抗氧化、促進(jìn)黑色素代謝的作用。復(fù)方中藥治療黃褐斑研究雖有限，但其主要機(jī)制與抑制黑素合成、黑素細(xì)胞增殖、抑制酪氨酸酶活性、清除多余超氧自由基、調(diào)節(jié)微量元素含量有密切關(guān)系，如逍遙散、桃紅四物湯、六味地黃丸、補(bǔ)中益氣湯、紅玉祛斑膠囊等［12-13］。

還有文獻(xiàn)報道，SOD活力降低，不足以清除生理狀態(tài)下的超氧自由基，反而使其含量相對增加，氧化反應(yīng)加劇，黑素生成過多，亦可促使黃褐斑形成。黑色素的生成與體內(nèi)的氧化和抗氧化機(jī)制有密切關(guān)系，若體內(nèi)氧化與抗氧化之間的動態(tài)平衡被破壞，將導(dǎo)致酪氨酸氧化反應(yīng)加速，黑色素形成過多而致黃褐斑。因此，抗氧化也是黃褐斑的治療的重要機(jī)制之一。

本實驗結(jié)果顯示，歸芷軟膠囊給藥組均能夠顯著降低黃褐斑模型小鼠肝臟、皮膚的酪氨酸酶的水平，凸顯現(xiàn)出歸芷軟膠囊主要是通過抑制小鼠體內(nèi)的酪氨酸酶的活性，降低酪氨酸水平，來減少黑色素的生成和沉著。據(jù)文獻(xiàn)報道，白芷提取物、當(dāng)歸提取物、珍珠粉、銀杏葉提取物對酪氨酸酶有抑制作用；同時，有文獻(xiàn)報道，主要通過抑制酪氨酸酶活性、促進(jìn)酪氨酸酶降解、抑制黑素細(xì)胞受體活性、阻礙黑素體的成熟和轉(zhuǎn)運過程、避免可能誘發(fā)和加重色斑的因素等［14］，與本實驗結(jié)果相符。

綜上所述，歸芷軟膠囊對黃褐斑小鼠模型有一定的保護(hù)和治療作用。其機(jī)制可能與抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素細(xì)胞的增殖，提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。這提示對黃褐斑的預(yù)防和治療還應(yīng)有其他機(jī)制，需進(jìn)一步研究，本研究為中藥預(yù)防和治療黃褐斑的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

［1］周春英，馬秋華，徐逢春.黃褐斑的研究進(jìn)展［J］.青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，41（6）：431-435.

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Experimental study on Guizhi Soft Capsules treating chloasm a

LIANG Chun， GUO Jian-ming， DUAN Jin-ao*， HUANG Jing， LIU Pei， QIAN Da-wei

（Jiangsu Collaborative Innovation Center of ChineseMedicinal Resources Industrialization，and Nationaland Local Collaborative Engineering Center of ChineseMedicinal Resources Industrialization and Formulae InnovativeMedicine，Nanjing University of ChineseMedicine，Nanjing 210023，China）

AIMTo observe the impacts of Guizhi Soft Capsules（Angelicae dahuricae Radix，Angelicae sinensis Radix，Pulvis Pernnlae，Ginko Folium，etc）on tyrosinase level，superoxide dismutase（SOD）activity，malondialdehyde（MDA）level in the liver and skin ofmousemodel for chloasma.METHODSSixty ICR femalemice of SPF grade were equally assigned into blank，model，Vitamin C，Guizhi Soft Capsules low-，middle-，and high-dose groups.Except the blank group，all of the rest animals received ultraviolet irradiation and intramuscular injection of progesterone，which induced chloasma.After the treatment，the liver and skin were collected，their tyrosinase level，SOD activity，malondialdehyde levelwere detected and Melan A on skin was observed by immunohistochemistry.RESULTSCompared with the model group，the tyrosinase and malondialdehyde levels in mouse skin and liver tissue，and the target skin area，the diameter（mean），the integrated optical density in the skin tissue of Guizhi Soft Capsules low-，middle-，and high-dose groups decreased significantly（P＜0.01 or P＜0.05）.The SOD activity in mouse skin tissue of the Vc group increased significantly（P＜0.05）.No significantdifferenceswere observed in other groups.CONCLUSIONGuizhi Soft Capsules plays a significant role in the protective and treatment of the mouse model for chloasma.Themechanism of the actionmay be related to inhibiting the activity of tyrosinase and the generation of skinmelanoma cell，and thus improves the oxidation resistance of tissues.

Guizhi Soft Capsules；chloasma；tyrosinase；superoxide dismutase；malondialdehyde；melanin

R285.5

A

1001-1528（2015）04-0716-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.006

2014-08-15

國家科技支撐計劃項目 （2011BAI04B03）

梁 春 （1989—），女，碩士，研究方向為中藥資源及資源化學(xué)、方劑功效物質(zhì)及中藥配伍禁忌。Tel：15205161014，E-mail：liangchunnj@126.com

*通信作者：段金廒 （1956—），博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥資源及資源化學(xué)、方劑功效物質(zhì)及中藥配伍禁忌。Tel：（025）85811116，E-mail：dja@njutcm.edu.cn