肖 夢， 江 濤*， 孫秋艷， 陳 聶， 馮燕梅

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016；2.邯鄲市第四醫(yī)院急診科，河北 邯鄲056200）

姜黃素對肺纖維化大鼠骨髓及外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響

肖 夢1， 江 濤1*， 孫秋艷2， 陳 聶1， 馮燕梅1

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016；2.邯鄲市第四醫(yī)院急診科，河北 邯鄲056200）

目的探討姜黃素對肺纖維化大鼠骨髓及外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞 （EPCs）數(shù)量、內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （eNOS）表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法采用經(jīng)氣管灌注博萊霉素 （BLM）的方法制作肺纖維化模型。60只大鼠完全隨機(jī)分為對照組、模型組、姜黃素組。每組于第14天、28天各處死10只大鼠。肺組織行HE染色觀察并進(jìn)行肺纖維化Ashcroft評級，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓及外周血中EPCs的數(shù)量，Western blot法檢測骨髓中eNOS蛋白的表達(dá)。結(jié)果姜黃素組肺泡炎和肺纖維化程度明顯低于模型組。與對照組比較，模型組各時間點骨髓及外周血EPCs數(shù)量及eNOS蛋白的表達(dá)明顯降低 （P＜0.01）。與模型組比較，姜黃素組各時間點骨髓及外周血EPCs數(shù)量及eNOS蛋白的表達(dá)亦明顯增多（P＜0.05）。結(jié)論姜黃素可上調(diào)肺纖維化大鼠骨髓及外周血EPCs數(shù)量，促進(jìn)EPCs動員入血，其作用可能與姜黃素激活eNOS通路相關(guān)。

姜黃素；大鼠；肺纖維化；骨髓；外周血；內(nèi)皮祖細(xì)胞 （EPCs）；內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （eNOS）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有治療方法療效差，病死率高［1］。因此，深入地探討肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而尋找治療肺纖維化的有效手段是目前研究的熱點。近幾年來肺血管的功能受損在肺纖維化中的作用日益受到學(xué)者們的重視［2］，已證實肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷存在于整個肺纖維化發(fā)病階段，電鏡下可觀察到血管內(nèi)膜的增厚和斷裂［3-4］。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作為一類具有增殖能力的干細(xì)胞，主要存在于機(jī)體的骨髓中，在某些病理生理環(huán)境下，可以從骨髓動員至外周血中，參與血管的再生與修復(fù)［5］。而內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase，eNOS）可調(diào)控一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成，同時激活基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases 9，MMP-9），促進(jìn)內(nèi)源性EPC的動員［6-7］。本研究通過觀察在姜黃素的干預(yù)作用下肺纖維化大鼠骨髓及外周血EPCs數(shù)量及eNOS蛋白表達(dá)的變化情況，初步探討姜黃素促進(jìn)EPCs動員及減輕肺纖維化的機(jī)制，為臨床上預(yù)防和治療肺纖維化提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器與動物分組 姜黃素 （購自四川金郁金公司，批號050302，純度95.6%）。博萊霉素注射液 （日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號740140）。硫氰酸熒光素 （FITC）標(biāo)記小鼠抗大鼠CD34抗體、羊抗鼠eNOS抗體及β-actin抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。紅細(xì)胞裂解液，Western相關(guān)試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所。FACSVantage SE流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。Western相關(guān)設(shè)備購自美國BIO-RAD公司。

清潔級成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供動物使用許可證號為SYXK（渝）2007-0001。并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。大鼠完全隨機(jī)分為對照組、模型組和姜黃素組。根據(jù)肺纖維化造模后觀察時間點，各組分為14 d、28 d 2個亞組。

1.2 動物模型制備 用3.5%的水合氯醛（1 mL/ 100 g）腹腔注射麻醉大鼠，頸部正中切口，鈍性分離，逐層暴露氣管，注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管。模型組和姜黃素組大鼠緩慢注入博萊霉素生理鹽水溶液（5 mg/kg）0.3 m L，對照組大鼠注入相同體積的生理鹽水，注后立即將動物直立并左右旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，縫合皮膚，繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.3 給藥方法 大鼠造模第2天后，給予各組大鼠灌胃處理。對照組和模型組大鼠每日給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶劑，給藥容量為0.014 L/kg。姜黃素大鼠每日給予200 mg/kg姜黃素羧甲基纖維素鈉溶液 （姜黃素在使用時將其溶于0.5%羧甲基纖維素鈉配成混懸液中）［8］。

1.4 取材方法 于造模后第14天及28天進(jìn)行2次取材，每次取材各組隨機(jī)處死10只大鼠。用3.5%的水合氯醛 （1 m L/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后，將其固定，2 mL真空抗凝管腹主動脈取血，混勻后作為流式細(xì)胞學(xué)檢測備用；夾閉腹主動脈，剪下大鼠雙側(cè)后肢，一部分用預(yù)冷的PBS沖洗出骨髓腔中的骨髓細(xì)胞，吹打均勻，用70μm的細(xì)胞篩過濾，調(diào)整細(xì)胞數(shù)在106～107次方左右作為流式細(xì)胞學(xué)檢測備用；另一部分直接取新鮮的骨髓，RIPA裂解液提取總蛋白，-80℃保存作為Western blot備用。打開胸腔，多聚甲醛灌注固定取肺葉。

1.5 肺組織病理學(xué)分析 取病變處肺葉，4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)梯度乙醇脫水后行石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，封片后在光鏡下觀察肺組織病理改變，按照Ashcroft等［9］的方法進(jìn)行肺纖維化嚴(yán)重度的形態(tài)學(xué)半定量分析。0級為正常肺組織；1級為肺泡或細(xì)支氣管壁輕微纖維性增厚；2級為介于1級與3級之間；3級為中度肺泡或細(xì)支氣管壁纖維性增厚，無明顯肺組織結(jié)構(gòu)破壞；4級為介于3級和5級之間；5級為纖維化增強(qiáng)伴有明確的組織結(jié)構(gòu)破壞，纖維束或纖維團(tuán)塊形成；6級為介于5級與7級之間；7級為肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，大的纖維化區(qū)域形成，可伴蜂窩肺形成；8級為整個肺組織區(qū)域纖維性閉塞。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血及骨髓EPCs數(shù)量

取外周血及骨髓細(xì)胞懸液各100μL，加入20μL小鼠抗大鼠FITC-CD34抗體孵育25 min后，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL避光孵育5 min，4℃下1 500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2次后，100μL PBS重懸細(xì)胞。4 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測CD34+EPCs數(shù)量 （占單核細(xì)胞數(shù)量的百分比）。

1.7 Western blot方法檢測骨髓中eNOS蛋白的表達(dá)情況 取新鮮骨髓，RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。加入蛋白標(biāo)本進(jìn)行SDS-PAGE（分離膠10%）凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入eNOS抗體（1：1 000），B-actin（1：1 000）抗體4℃孵育過夜后復(fù)溫2 h，TBST洗膜后放入二抗中孵育2 h，TBST洗膜后ECL顯色，凝膠成像儀顯像，采用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，用eNOS的灰度值與B-actin的灰度值的比值表示eNOS蛋白相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （）表示，采用方差分析和LSD檢驗。檢驗水準(zhǔn)α= 0.05，P＜0.05時為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)觀察 光鏡下觀察見圖1，對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，模型組第14天時肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬；第28天時，大量肺泡腔塌陷、消失，由膠原和纖維蛋白占據(jù)。姜黃素組第14天炎癥細(xì)胞滲出較模型組輕，肺泡間隔輕度增厚；第28天，肺組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，少量肺泡萎陷，肺泡間隔明顯增寬。根據(jù)Ashcroft評分標(biāo)準(zhǔn)模型組肺纖維化程度在不同時間點均明顯高于對照組 （P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素組肺組織肺纖維化程度均有不同程度的改善，見表1。

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)變化 （HE×100）Fig.1 Pathologic changes of the rat lung tissue（HE×100）

表1 肺纖維化Ashcroft評分（，n=10）Tab.1 Ashcroft score of pulmonary fibrosis（，n=10）

表1 肺纖維化Ashcroft評分（，n=10）Tab.1 Ashcroft score of pulmonary fibrosis（，n=10）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

組別 第14天 第28天0.52±0.21 0.53±0.26模型組 3.75±0.35* 5.27±0.51*姜黃素組 2.46±0.31△ 4.01±0.40對照組△

2.2 大鼠骨髓EPCs數(shù)量變化 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，大鼠肺纖維化造模后第14天、28天骨髓EPCs數(shù)量明顯低于對照組 （P＜0.01）；姜黃素組在第14天時EPCs數(shù)量高于模型組 （P＜0.05），在第28天時顯著高于模型組 （P＜0.01）。見圖2。

2.3 大鼠外周血EPCs數(shù)量變化 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，大鼠肺纖維化造模后第14天、第28天外周血EPCs數(shù)量明顯低于對照組（P＜0.01）；姜黃素組在第14天時EPCs數(shù)量高于模型組（P＜0.05），在第28天時顯著高于模型組 （P＜0.01）。見圖3。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)顯示各組骨髓EPCs數(shù)量的變化（，n=10）Fig.2 Quantitative evaluation of EPCs in bonemarrow by flow cytometry in each group（，n=10）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)顯示各組外周血EPCs數(shù)量的變化（，n=10）Fig.3 Quantitative evaluation of EPCs in peripheral blood by flow cytometry in each group（，n=10）

2.4 姜黃素可上調(diào)肺纖維化大鼠eNOS蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示模型組中eNOS蛋白的表達(dá)在肺纖維化造模后第14天及28天均明顯低于對照組 （P＜0.01）。而姜黃素組在第14天及28天eNOS表達(dá)明顯高于模型組 （P＜0.01），見圖4。

3 討論

圖4 W estern-blot顯示各組eNOS蛋白的表達(dá)變化（，n=10）Fig.4 Exp ression of eNOS protein by W estern-blot in each group（，n=10）

肺纖維化作為一種慢性進(jìn)展性疾病，其主要的病理特點是彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。然而慢性炎癥除了累及肺泡外，還會漸漸蔓延到肺間質(zhì)乃至肺血管。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的不斷損傷會引起血管通透性增加，加速肺纖維化病情惡化的進(jìn)程。EPCs作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮功能［10］。EPCs的表面標(biāo)記物主要有VEGFR2、CD34、CD31、CD133等，其中CD34+EPCs雖然不能準(zhǔn)確代表EPCs，但研究表明其具有較強(qiáng)的血管修復(fù)能力［11］。故本研究采用CD34標(biāo)記骨髓及外周血的EPCs。但在長期炎癥、低氧、氧化應(yīng)激等環(huán)境條件下，EPCs分化受阻且EPCs的動員也受到抑制，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及肺血管的損傷。NO是一種內(nèi)源性的血管舒張因子，分泌過程受到限速酶eNOS的調(diào)控，一方面能激活MMP-9，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員［12］；另一方面NO可抑制血管平滑肌的增殖，使受損的血管恢復(fù)彈性，修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能［13］。在肺纖維化發(fā)病過程中eNOS活性下降，NO合成減少，EPCs的動員與分化減少，使血管內(nèi)皮功能紊亂，此結(jié)果與Malli等人［14-15］的報道結(jié)果相似。因此，增強(qiáng)eNOS蛋白的表達(dá)，促進(jìn)骨髓EPCs的分化與動員，可能成為肺纖維化治療的新思路。

姜黃素是從姜科植物姜黃的地下根莖中分離出的主要活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、降脂、抗腫瘤等廣泛的作用。同時姜黃素具有藥物濃度安全范圍大，毒副作用小，價格低廉等特點，為該藥走向臨床提供了很好的先決條件［16］。以往的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素有保護(hù)并改善血管內(nèi)皮功能的作用［17］。然而姜黃素是否對肺纖維化的血管內(nèi)皮細(xì)胞也起同樣的保護(hù)作用，目前尚無相關(guān)研究。本實驗以肺纖維化大鼠為研究對象，在姜黃素干預(yù)下肺組織纖維化情況明顯減輕，eNOS的表達(dá)上調(diào)，骨髓和血中EPCs數(shù)量降低情況也明顯好轉(zhuǎn)。由此可見，姜黃素可促進(jìn)肺纖維化大鼠骨髓CD34+EPCs的動員，增加骨髓及外周血CD34+EPCs數(shù)量，減輕肺泡炎和肺纖維化程度，且這一作用可能與激活eNOS通路相關(guān)。

本研究明確了姜黃素在肺纖維化大鼠模型中抗纖維化作用。進(jìn)一步充實了姜黃素的作用機(jī)理，為姜黃素治療肺纖維化及提供了初步的理論依據(jù)。鑒于姜黃素對肺纖維化骨髓EPCs的動員及肺血管修復(fù)作用機(jī)制頗為復(fù)雜，涉及多種信號分子通路，其更為完善的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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Effect of curcum in on endothelial progenitor cells on bonemarrow and peripheral blood in rats with pulmonary fibrosis

XIAO Meng1， JIANG Tao1*， SUN Qiu-yan2， CHENG Nie1， FENG Yan-mei1

（1.Department of Respiratory Diseases，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Department of Emergency，The Forth Hospital of Handan，Handan 056200，China）

AIMTo study the effect of curcumin on the number of endothelial progenitor cells，（EPCs）the protein expression of eNOS in bone marrow and peripheral blood in rats with pulmonary fibrosis and explore their possible mechanism.METHODSPulmonary fibrosismodel of SD ratswas reproduced by the single intratracheal perfusion of bleomycin.Sixty rats were randomly divided into the control group，model group，and curcumin group.Ten ratswere sacrificed from each group on the 14thand 28thday.The lung tissue was observed by HE staining and evaluated for the formation of lung fibrosis by using Ashcroft scoring system.Flow cytometer was used to determine the percentage of EPCs in bonemarrow and peripheral blood.The protein expression of eNOSwas detected by Western-blot.RESULTSThe alveolitis and the pulmonary fibrosis in the curcumin group were significantly alleviated.In comparison with the control group，the percentage of EPCs in bone marrow and peripheral blood and the protein expression of eNOSwere significantly reduced in themodel group（P＜0.01）.In comparison with themodel group，the percentage of EPCs in bonemarrow and peripheral blood and the protein expression of eNOS were significantly up-regulated in curcumin group（P＜0.05）.CONCLUSIONSCurcumin can effectively upregulate the percentage of EPCs in bone marrow and peripheral blood，and help bone marrow EPCsmigrate into peripheral blood through activating eNOS pathway in rats with pulmonary fibrosis.

curcumin；rat；pulmonary fibrosis；bonemarrow；peripheral blood；endothelial progenitor cells（EPCs）；eNOS

R285.5

A

1001-1528（2015）04-0700-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.003

2014-08-15

重慶市科委應(yīng)用開發(fā)重大基金（cstc2014yyKfA110026）

肖 夢（1989—），女，碩士生。Tel：18716296820，E-mail：409488586@qq.com

*通信作者：江 濤，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向為慢性肺部疾病的研究。E-mail：j.tcq@163.com