趙柏雄 田衍平 蔡其燕 李紅麗＊

（1第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅四營(yíng)，2組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室、發(fā)育生物學(xué)教研室，重慶400038）

少突膠質(zhì)細(xì)胞（Oligodendrocytes，OLs）的發(fā)育具有明顯的階段性，其中晚期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞對(duì)缺血缺氧損傷非常敏感［1］，極易發(fā)生損傷乃至凋亡阻礙髓鞘的發(fā)育成熟，這也被認(rèn)為是新生兒腦白質(zhì)軟化癥發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧損傷會(huì)導(dǎo)致氯離子（chloride，Cl－）通道的過(guò)度開(kāi)放，影響細(xì)胞的各種生理活動(dòng)［4］。電壓門控Cl－通道2型（ClC2）主要參與發(fā)育中細(xì)胞的容積和滲透壓調(diào)節(jié)，尤其在細(xì)胞損傷早期常與凋亡性細(xì)胞皺縮（AVD）密切相關(guān)，對(duì)早期凋亡有重要影響［5］。研究已經(jīng)證實(shí)在缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞中Cl－通道將大幅度增加開(kāi)放［6］；4，4－二異硫氰基芪－2，2＇－二磺酸（4，4＇－Diisothiocyanostilbene－2，2＇－disulfonic acid，DIDS）可以減輕 Cl－通道的過(guò)度開(kāi)放，抑制心肌細(xì)胞被誘導(dǎo)的AVD，將啟動(dòng)凋亡的細(xì)胞從細(xì)胞凋亡中拯救回來(lái)［7，8］，表明阻斷Cl－通道可以保護(hù)缺血再灌注損傷后的心肌細(xì)胞。因此DIDS也被認(rèn)為是潛在的缺血缺氧保護(hù)劑而受到廣泛關(guān)注，開(kāi)始在全身展開(kāi)廣泛研究，有報(bào)道稱在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中得到了相似的結(jié)論［9］，但在腦白質(zhì)區(qū)OLs中作用如何，尚未得到確認(rèn)。DIDS的缺血缺氧損傷保護(hù)機(jī)制極有可能是參與了細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的平衡調(diào)控。OLs中存在著一套比心肌細(xì)胞更完善的抗氧化系統(tǒng)，可以防御缺血缺氧帶來(lái)的損傷，但氧自由基清除能力的下降、炎性因子的毒性作用［10］以及代謝途徑的改變等都會(huì)阻礙抗氧化系統(tǒng)的發(fā)育并破壞原有抗氧化系統(tǒng)的平衡從而導(dǎo)致OL受損、凋亡。本文旨在探討Cl－通道在缺血缺氧導(dǎo)致的OLs損傷中的作用，明確DIDS對(duì)OLs缺血缺氧性損傷的保護(hù)效應(yīng)，并尋找合適的給藥時(shí)間。

材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立

清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)健康3－5日齡新生Sprague－Dawley（SD）大鼠30只（雌雄不限），體重（body weight，BW）為7±2g，第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。慢性腦缺血缺氧模型采用改良Levine法建立，新生3－5日齡SD大鼠常規(guī)手術(shù)消毒頸部皮膚，行頸部正中切口約5－8mm，游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎，縫合皮膚后送入新生大鼠缺氧缸，置于8%低氧濃度和36－37℃環(huán)境溫度下2h后取出，送回母鼠身邊繼續(xù)哺乳。按實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)取材。

2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

共分為5組：假手術(shù)組、缺血缺氧損傷組、缺血缺氧后1h應(yīng)用DIDS治療組、缺血缺氧后6h應(yīng)用DIDS治療組、預(yù)用DIDS 2h后缺血缺氧損傷組。DIDS（sigma公司）采用腹腔注射法，用量為5mg／kg體重。

3．取材

分別于缺血缺氧手術(shù)后1d、3d、7d時(shí)處死大鼠，取腦白質(zhì)組織，分別制成細(xì)胞懸液，提取蛋白、提取總RNA，以及固定組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，切片厚20μm。

4．RT－PCR技術(shù)

按總RNA提取試劑盒的說(shuō)明，采用一步法提取RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)，并經(jīng)1．0%瓊脂糖凝膠電泳70V，1h鑒定，28s、18s條帶清晰可見(jiàn)，無(wú)明顯降解，將樣品置于－80℃冰箱保存。按照試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA第一鏈，然后進(jìn)行PCR 30個(gè)循環(huán)（94℃30s，54℃退火30s，72℃45s，72℃延伸5min）。PCR反應(yīng)結(jié)束后，以1．0%的瓊脂糖進(jìn)行DNA凝膠電泳：90V，30min。在紫外燈下觀察電泳條帶并照相。以Gel－Doc1000凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，檢測(cè)電泳條帶光密度值，以β－actin作內(nèi)參校正，以實(shí)現(xiàn)結(jié)果的半定量分析。其中引物序列如下：ClC2 引 物 上 游 序 列：5′－AGA CAA TCC CTA CAC CCT TCA A－3′，下游序 列：5′－TGT CGG TAG AAC ACC TTG TCA C－3′；TNF－α引物上游序列：5′－TGT GCC TCA GCC TCT TCT CAT－3′，下游序列：5′－ACC ACC AGT TGG TTG TCT TTG A－3′；iNOS 引 物 上 游 序 列：5′－TTG GAG CGA GTT GTG GAT TGT－3′，下游序列：5′－CGT TGT ACT CTG AGG GCT GAC A－3′；βactin引物上游序列：5′－GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC－3′，下游序列：5′－TCG GGG GAT CGG AAC CGC TCA－3′。

5．蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）

將所取腦白質(zhì)組織研磨成勻漿，測(cè)定樣品中蛋白濃度后，用十二烷基硫酸鈉緩沖液與蛋白樣品等體積混合，置于水浴鍋中恒溫變性。將變性處理過(guò)的蛋白樣品加入濃縮膠中，每孔加蛋白20μg進(jìn)行電泳，電壓90V。蛋白進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V。電泳結(jié)束后，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件：恒定電流150mA，轉(zhuǎn)移90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜放入封閉液中封閉。封閉結(jié)束后膜上蛋白分別依次與ClC2及caspase－3一抗、二抗結(jié)合，一抗結(jié)合過(guò)夜，二抗結(jié)合1h。二抗結(jié)合結(jié)束后，在膜上加ECL化學(xué)發(fā)光底物，反應(yīng)5min后于暗室內(nèi)將膠片置于轉(zhuǎn)移膜上曝光，顯影、定影后以凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

6．免疫組化及免疫熒光染色技術(shù)

切片經(jīng)0．01mol／L PBS充分洗滌后置于3%H2O2去離子水孵育5－10min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶，滴加抗體［兔來(lái)源ClC2（1：1000）］，4℃冰箱過(guò)夜，PBS液沖洗，2min 3次。滴加二抗［抗兔IgG（1∶200）］ ，室溫孵育20－30min，PBS液沖洗，2 min 3次。DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡觀察。熒光染色技術(shù)中滴加抗體為［兔來(lái)源 ClC2 （1：1000）、鼠來(lái)源caspase－3（1：500）］，熒光二抗為［抗兔IgG （1∶200）、抗鼠IgG（1∶200）］，Dako封片后熒光顯微鏡下觀察。

7．細(xì)胞活性氧濃度檢測(cè)

取1ml蛋白提取液，依據(jù)活性氧檢測(cè)試劑盒說(shuō)明加入DCFH－DA 1μl，37℃避光孵育30min，加入1μl Rosup陽(yáng)性對(duì)照刺激細(xì)胞，25min后以525nm激發(fā)波長(zhǎng)于分光光度計(jì)下讀數(shù)。

8．流式細(xì)胞檢測(cè)

分離的細(xì)胞約1x106，離心沉淀后用0．3ml含10%小牛血清的PBS懸浮，移入1．5ml EP管中，加入0．7ml無(wú)水乙醇，置－20℃下固定細(xì)胞24h以上，3000rpm離心細(xì)胞30s，吸棄上清，用1ml PBS重懸細(xì)胞，再離心洗滌細(xì)胞一次，吸棄上清，沉淀細(xì)胞用100μl 1mg／ml RNase A 懸浮，37℃30min，再加入400μl 50μg／ml PI，置暗處10min后上機(jī)檢測(cè)。

9．盧卡斯快藍(lán)染色

將冰凍切片裱在已包被的載玻片上，37℃烤片2h，LFB染液，37℃孵育過(guò)夜，95%乙醇洗去多余染液，蒸餾水漂洗，0．05%Li2CO3溶液分色10s，70%乙醇繼續(xù)分色1min，蒸餾水反復(fù)漂洗，直至灰質(zhì)與白質(zhì)有鮮明對(duì)比，80%、95%、100%乙醇梯度脫水各10min，二甲苯透明15min，中性樹(shù)膠封片。

10．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’t檢驗(yàn)；均以P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0．05為無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．缺血缺氧損傷對(duì)ClC2mRNA及蛋白表達(dá)的影響

缺血缺氧損傷1d后，ClC2mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)（P＜0．01），且在3d，7d后 ClC2 mRNA表達(dá)仍呈上升趨勢(shì)（見(jiàn)圖1）。缺血缺氧1h和6h后使用DIDS治療組，ClC2mRNA表達(dá)均較缺血缺氧組明顯降低，其中術(shù)后1h應(yīng)用DIDS組降低最為顯著（P＜0．01）。術(shù)后3d，預(yù)用DIDS 2h后缺血缺氧損傷組ClC2mRNA表達(dá)與單純?nèi)毖毖鯎p傷組未見(jiàn)變化，而術(shù)后1h應(yīng)用DIDS對(duì)ClC2表達(dá)影響較大（P＜0．01）（見(jiàn)圖2）。

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧組較假手術(shù)組ClC2蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0．01），術(shù)后1h應(yīng)用DIDS可以明顯抑制ClC2蛋白的表達(dá)（P＜0．05）（見(jiàn)圖3）。

圖1 缺血缺氧術(shù)后腦白質(zhì)中ClC2mRNA表達(dá)變化1．sham operation group；2．hypoxic－ischemic damage group－1d；3．hypoxic－ischemic damage group－3d；4．hypoxicischemic damage group－7d；Note：compared with sham operation group，＊＊P＜0．01 Fig．1ClC－2mRNA expression changes in cerebral white matter after hypoxic－ischemic injury．

1．假手術(shù)組；2．缺血缺氧組1d；3．缺血缺氧組3d；4．缺血缺氧組7d；

圖2 缺血缺氧處理及應(yīng)用DIDS后ClC2mRNA相對(duì)表達(dá)量1．sham－operation group．2．ischemic and hypoxia group．3．a(chǎn)dministration of DIDS at 1hafter injury．4．a(chǎn)dministration of DIDS at 6hafter injury．5．a(chǎn)dministration of DIDS at 2hbefore injury．Note：compared with sham operation group，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01Fig．2ClC－2mRNA relative expression changes in cerebral white matter before and after hypoxic－ischemic injury．

圖3 缺血缺氧處理及應(yīng)用DIDS后ClC2蛋白相對(duì)表達(dá)量1．sham－operation group．2．ischemic and hypoxia group．3．a(chǎn)dministration of DIDS at 1hafter injury．Note：compared with sham operation group，＊＊P＜0．01；compared with ischemic and hypoxia group，＃P＜0．05 Fig．3ClC－2protein relative expression changes after hypoxic－ischemic injury．

1．假手術(shù)組；2．缺血缺氧組；3．術(shù)后1h用DIDS組

2．缺氧后應(yīng)用DIDS對(duì)腦白質(zhì)細(xì)胞活性氧及炎性發(fā)生的影響

活性氧濃度在缺血缺氧組術(shù)后1d較假手術(shù)組顯著升高（P＜0．01），且術(shù)后1h應(yīng)用DIDS后活性氧濃度大幅回落（P＜0．05），術(shù)后6h應(yīng)用DIDS組也有不同程度的活性氧濃度降低（P＜0．05）。術(shù)后3d檢測(cè)結(jié)果顯示，缺血缺氧組比假手術(shù)組仍增高（P＜0．01）；術(shù)后1h應(yīng)用DIDS組較缺血缺氧組則呈明顯降低（P＜0．05）。術(shù)后7d檢測(cè)僅缺血缺氧組較假手術(shù)組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別意義（P＜0．05），其余各組未見(jiàn)差異（見(jiàn)圖4）。

細(xì)胞炎性因子iNOS、TNF－α的mRNA檢測(cè)顯示：在術(shù)后3d，缺血缺氧組明顯高于假手術(shù)組（P＜0．01），術(shù)后1h應(yīng)用DIDS、術(shù)后6h應(yīng)用DIDS以及提前2h預(yù)用DIDS均能夠使iNOS、TNF－αmRNA表達(dá)降低，其中以術(shù)后1h應(yīng)用DIDS組作用最為明顯（見(jiàn)圖5）。與缺血缺氧組相比＃P＜0．05，＃＃P＜0．01。

圖4 各組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)腦白質(zhì)活性氧濃度檢測(cè)1．sham－operation group．2．ischemic and hypoxia group．3．a(chǎn)dministration of DIDS at 1hafter injury．4．a(chǎn)dministration of DIDS at 6hafter injury．5．a(chǎn)dministration of DIDS at 2hbefore injury．Note：compared with sham operation group，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；compared with ischemic and hypoxia group，＃P＜0．05，＃＃P＜0．01Fig．4The changes of active oxygen in cerebral white matter of each group at different time points after hypoxic－ischemic injury．

圖5 各組術(shù)后3d腦白質(zhì)中炎性因子mRNA表達(dá)量1．sham－operation group．2．ischemic and hypoxia group．3．a(chǎn)dministration of DIDS at 1hafter injury．4．a(chǎn)dministration of DIDS at 6hafter injury．5．a(chǎn)dministration of DIDS at 2hbefore injury．Note：compared with sham operation group，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；compared with ischemic and hypoxia group，＃P＜0．05，＃＃P＜0．01Fig．5The changes of inflammatory factor mRNA expression by RT－PCR in cerebral white matter of each group after 3days of hypoxic－ischemic injury．

3．缺血缺氧后應(yīng)用DIDS對(duì)髓鞘發(fā)育的影響

在術(shù)后3d，正常大鼠腦白質(zhì)盧卡斯快藍(lán)染色應(yīng)呈明顯的藍(lán)色均染，與白質(zhì)外組織界限清晰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺血缺氧組染色淺淡，平均光密度值較假手術(shù)組有明顯下降，藍(lán)染區(qū)域明顯縮小。術(shù)后1h應(yīng)用DIDS組平均光密度值，較缺血缺氧組有較大回升，但仍低于假手術(shù)組（見(jiàn)圖6）。

圖6 盧卡斯快藍(lán)染色檢測(cè)缺血缺氧對(duì)大鼠髓鞘發(fā)育的影響A、B．sham－operation group；C、D．ischemic and hypoxia group；E、F．a(chǎn)dministration of DIDS at 1hafter injury；1．shamoperation group；2．ischemic and hypoxia group；3．a(chǎn)dministration of DIDS at 1hafter injuryNote：compared with sham operation group，＊＊P＜0．01；compared with ischemic and hypoxia group，＃P＜0．05Fig．6The changes of myelin development by myelin specific staining after hypoxic－ischemic injury．

4．阻斷氯離子通道對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

免疫熒光染色中紅色熒光標(biāo)記caspase－3，分布于胞漿，綠色熒光標(biāo)記ClC2，分布于胞核與胞漿，雙標(biāo)記細(xì)胞呈黃色。結(jié)果顯示術(shù)后3d缺血缺氧組胼胝體等區(qū)caspase－3及ClC2特異性標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞比例均較假手術(shù)組顯著升高（P＜0．01），提示凋亡細(xì)胞增加且與ClC2相關(guān)。術(shù)后1h應(yīng)用DIDS能夠減輕缺血缺氧所帶來(lái)的細(xì)胞凋亡途徑的激活，效果顯著（P＜0．01）（見(jiàn)圖7）。

A、B、C．假手術(shù)組；D、E、F．缺血缺氧組；G、H、I．術(shù)后1h用DIDS組；1．假手術(shù)組；2．缺血缺氧組；3．術(shù)后1h用DIDS組注：與假手術(shù)組相比 ＊＊P＜0．01；與缺血缺氧組相比 ＃P＜0．05，＃＃P＜0．01。圖7 免疫組織化學(xué)熒光檢測(cè)缺血缺氧對(duì)胼胝體caspase－3及ClC2蛋白表達(dá)的影響A、B、C．sham－operation group；D、E、F．ischemic and hypoxia group；G、H、I．a(chǎn)dministration of DIDS at 1hafter injury；1．sham－operation group；2．ischemic and hypoxia group；3．a(chǎn)dministration of DIDS at 1hafter injuryNote：compared with sham operation group，＊＊P＜0．01；compared with ischemic and hypoxia group，＃P＜0．05，＃＃P＜0．01Fig．7The changes of the number of double labeled by caspase－3and CLC2positive cells after hypoxic－ischemic injury．

討 論

Cl－通道是哺乳動(dòng)物體內(nèi)能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Cl－及少數(shù)其他陰離子的通道蛋白，通常被認(rèn)為是陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)的代表，參與各種復(fù)雜的生理代謝過(guò)程［11］。最新的研究表明Cl－通道阻斷劑在保護(hù)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中有重要作用，但未得到全身各器官組織細(xì)胞的廣泛驗(yàn)證，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)。缺血缺氧這一常見(jiàn)的病理?yè)p傷會(huì)帶來(lái)諸如細(xì)胞凋亡等極其嚴(yán)重的后果。OLs在未成熟期作為缺血缺氧敏感性細(xì)胞，盡管其自身存在一套抗氧化系統(tǒng)，但胞膜含有豐富的脂質(zhì)、胞內(nèi)含有豐富的鐵和較少的抗氧化酶等因素均決定了其容易受到氧化應(yīng)激損傷的特點(diǎn)［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺血缺氧后腦白質(zhì)區(qū)ClC2表達(dá)增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞比例大幅上升，阻礙髓鞘正常發(fā)育。及時(shí)應(yīng)用DIDS后，能夠大幅緩解缺血缺氧帶來(lái)的各項(xiàng)生理改變。證明Cl－通道阻斷劑在神經(jīng)系統(tǒng)OLs中也有明顯的缺血缺氧保護(hù)作用。

抗氧化系統(tǒng)的失衡最明顯的表現(xiàn)就是細(xì)胞內(nèi)氧化性物質(zhì)濃度的升高，我們發(fā)現(xiàn)缺血缺氧損傷后腦白質(zhì)區(qū)細(xì)胞中活性氧濃度大幅升高。高濃度的活性氧對(duì)OLs來(lái)說(shuō)有明顯的細(xì)胞毒性作用，將導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔過(guò)度開(kāi)放，使胞膜通透性增加，引起促凋亡蛋白如細(xì)胞色素C或凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，細(xì)胞色素C通過(guò)觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起繼發(fā)性核酸內(nèi)切酶的活化來(lái)觸發(fā)凋亡［13，14］。且在活體細(xì)胞中活性氧的主要目標(biāo)之一就是線粒體，這將導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的損傷［15］。

此外，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DIDS的缺血缺氧損傷保護(hù)作用是通過(guò)降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)現(xiàn)的［16］。感染或炎癥作用于OLs也可產(chǎn)生一系列改變，導(dǎo)致毒性產(chǎn)物的分泌，尤其氧化／抗氧化狀態(tài)及活化OLs釋放細(xì)胞因子IL－1、TNF－α、INF－γ，均可打破 OLs抗氧化系統(tǒng)的平衡［17］。INF－γ對(duì)OLs前體有直接的損傷作用，而OL前體細(xì)胞膜上恰恰表達(dá)有INF－γ的受體，并且TNF－α可輔助INF－γ對(duì)OLs前體細(xì)胞的損傷作用［18］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血缺氧后腦白質(zhì)細(xì)胞中 TNF－α、iNOS mRNA表達(dá)明顯升高，證明炎性因子在缺血缺氧損傷中有重要作用。

凋亡是抗氧化系統(tǒng)失衡的一個(gè)嚴(yán)重后果之一，也是可以觀察到的氧化損傷的較為直觀的指標(biāo)之一。氧化損傷后的OLs主要病理改變?yōu)榈蛲觯?9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺血缺氧將導(dǎo)致腦白質(zhì)區(qū)OLs凋亡比例大幅升高，影響髓鞘的生長(zhǎng)發(fā)育。近期，Y．Okada等［20］發(fā)現(xiàn)阻斷 Cl－通道可抑制早期凋亡的激活從而抑制細(xì)胞凋亡，也可保護(hù)缺血缺氧損傷后的心肌細(xì)胞。凋亡這一現(xiàn)象在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育期間以及許多神經(jīng)退行性疾病如腦中風(fēng)、腦創(chuàng)傷、Alzhehaer’s病、Parkinson’s病、Huntington’s病等的病理性神經(jīng)細(xì)胞死亡中都有重要作用［21］。且Pamenter ME等［22］認(rèn)為DIDS能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的包膜完整性，提高細(xì)胞存活率，研究人員在一氧化氮誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Cl－通道參與了在體腦缺血以及離體缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的凋亡，提示其在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞缺血缺氧性凋亡過(guò)程中也有重要作用。Blanz J等［23］敲除小鼠ClC2基因，可以觀察到隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，在髓鞘形成階段，腦和脊髓白質(zhì)出現(xiàn)了嚴(yán)重的進(jìn)行性海綿狀空泡變性。提示Cl－通道對(duì)于OLs的發(fā)育及正常功能的實(shí)現(xiàn)具有重要作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血缺氧將會(huì)誘導(dǎo)發(fā)生新生大鼠腦白質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)OLs的凋亡壞死，影響髓鞘正常發(fā)育。及時(shí)在缺血缺氧損傷后1h應(yīng)用DIDS，細(xì)胞內(nèi)活性氧、炎性因子等濃度將大幅下降，明顯低于缺血缺氧組，可以起到顯著的缺血缺氧損傷保護(hù)作用，且在分子、蛋白和細(xì)胞水平均得到驗(yàn)證。缺血缺氧損傷后6h應(yīng)用DIDS后的細(xì)胞保護(hù)作用將有所下降，但仍然有一定作用。提前2h應(yīng)用DIDS與缺血缺氧組各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步表明DIDS是通過(guò)阻斷缺血缺氧后Cl－通道的開(kāi)放而發(fā)揮其作用的，但是是否存在其他作用機(jī)制仍有待更深入的研究。

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