吳 樂 劉子建 黎紅華 武 強

（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢430070；1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系，武漢430030）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種嚴重危害人類健康的疾病之一，是導(dǎo)致缺血性心腦血管疾病的重要原因，但其確切病因和發(fā)病機制迄今尚未完全闡明。1999年Ross提出“動脈粥樣硬化是慢性炎癥”的學(xué)說［1］，得到了大多數(shù)學(xué)者的認可。最新證據(jù)表明5－脂氧酶（5－lipoxygenase，5－LOX）在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，以及動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性中起到了非常重要的作用［2］。普羅布考（probuco1）最初是作為一個降脂藥物而應(yīng)用于臨床，近年來的研究表明，普羅布考具有較強的抗氧化作用，這使其在抗AS病變中具有重要意義。本研究以高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)兔高同型半胱氨酸（homocysterine，Hcy）血癥及AS模型，探討普羅布考對兔主動脈粥樣硬化及5－LOX表達的影響。

材料和方法

1．實驗動物和藥物

雄性純種新西蘭大白兔24只，體重2．0－2．5 kg，購自湖北省動物實驗中心。普羅布考粉劑購自山東齊魯制藥有限公司。

2．主要試劑

5－LOX引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計并合成。兔抗5－LOX購自美國BD公司，二抗（羊抗兔和羊抗鼠）購自武漢Boster公司。

3．實驗分組、造模及給藥

動物隨機分為3組，每組8只：對照組，基礎(chǔ)飼料200g／d，共20w；模型組，喂高蛋氨酸飼料200 g／d（基礎(chǔ)飼料中加入1%蛋氨酸），共20w［3，4］；治療組，喂高蛋氨酸飼料200g／d基礎(chǔ)上，從第12w開始給予普羅布考1g／d灌胃，共20w。

4．病理形態(tài)學(xué)觀察

末次給藥后24h禁食，不禁水，用氣栓法處死動物，快速打開腹腔剝離腹主動脈，剪取約0．5cm腹主動脈，10%中性福爾馬林固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，蘇木精－伊紅染色后于光鏡下觀察。余腹主動脈－80℃凍存。

5．RT－PCR檢測腹主動脈中5－LOX的mRNA表達水平總RNA的提取

按照Trizol說明書方法提取組織總RNA，測定總RNA濃度及純度。RT－PCR反應(yīng) 在25μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，以4μg總RNA為模板，用Mix逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列如下：5－LOX ：5＇－AAATCTGGGTGCGTTCAA－3＇（上游，5＇－GGGATGTCCTCGGTGTTGT－3＇（下游），擴增片段為328bp；GAPDH：5＇－TCCACTCACGGCAAATTCMC－3＇（上 游），5＇－ACTCCACGACATACTCAGCAC－3＇（下游），擴增片段為14 2bp。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s×33個循環(huán)，72℃終末延伸5min。擴增產(chǎn)物以1．6%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進行半定量分析。每個實驗組重復(fù)六次進行統(tǒng)計學(xué)分析。

6．Western免疫印跡法檢測5－LOX的蛋白水平

提取各組腹主動脈蛋白，并用BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度，計算上樣量，保持各組上樣蛋白質(zhì)量的一致。進行10%SDS－PAGE凝膠電泳，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜1．5h，轉(zhuǎn)膜后的NC膜用50g／l脫脂奶粉緩沖封閉液封閉1h，加一抗4℃孵育過夜，一抗為兔抗5－LOX（1∶1000），鼠抗β－Actin（1∶400）。之后洗膜15min×3，二抗37℃孵育1h，二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔，羊抗鼠（1∶10000）。然后洗膜15min×3，洗去未結(jié)合的二抗，用增強化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）洗片，暗室曝光膠片。測定條帶反應(yīng)灰度值，以β－Actin為內(nèi)參計算相對值，每組實驗重復(fù)六次進行統(tǒng)計學(xué)分析。

7．統(tǒng)計學(xué)處理

我們采用了SPSS17．0軟件，所有的實驗數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的各個統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。對于實驗組間的統(tǒng)計學(xué)差異，我們采用了單因素方差分析（ANOVA），組間的兩兩比較采用Student－Newman－Keuls檢驗。P值＜0．05表明各個組間的差異是有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色顯示對照組血管壁內(nèi)膜光滑完整，中膜平滑肌細胞排列規(guī)則（圖1A）；模型組血管內(nèi)膜明顯增厚，中膜平滑肌細胞排列紊亂（圖1B）；治療組血管內(nèi)膜增厚明顯減輕，中膜平滑肌細胞排列規(guī)則（圖1C）。

圖1 A：對照組腹主動脈組織形態(tài)學(xué)×200；B：模型組腹主動脈組織形態(tài)學(xué)×200；C：治療組腹主動脈組織形態(tài)學(xué)×200；標(biāo)尺＝200μm。Fig．1A：The aortic tissue morphology in the control group．×200；B：The aortic tissue morphology in the model group．×200；C：The aortic tissue morphology in the treatment group．×200，Bar＝200μm．

2．腹主動脈5－LOX的mRNA表達變化

RT－PCR結(jié)果見圖2，根據(jù)電泳結(jié)果顯示，模型組腹主動脈5－LOX的mRNA表達水平較對照組明顯增高（＊P＜0．05）。治療組腹主動脈5－LOX的mRNA表達明顯降低，與模型組相比差異顯著（＊＊P＜0．05）。

圖2 各組腹主動脈5－LOX的mRNA表達。＊P＜0．05與對照組比較；＊＊P＜0．05與模型組比較。Fig．2 5－LOX mRNA expression in aorta．＊P＜0．05 compared with the control group；＊＊P＜0．05compared with the model group．

3．腹主動脈5－LOX的蛋白表達變化

Western印跡分析結(jié)果見圖3，模型組5－LOX蛋白表達較對照組明顯增高，差異有顯著性（＊P＜0．05）。治療組5－LOX蛋白表達明顯降低，與模型組相比差異顯著（＊＊P＜0．05）。

圖3 各組腹主動脈5－LOX的蛋白表達。＊P＜0．05與對照組比較；＊＊P＜0．05與模型組比較。Fig．3 5－LOX protein expression in aorta．＊P＜ 0．05 compared with the control group；＊＊P＜0．05compared with the model group．

討 論

臨床試驗及流行病學(xué)研究證實血漿Hcy水平升高是心血管疾病的一個獨立的危險因素，且血漿Hcy水平嚴重升高的患者通常伴有早發(fā)性的AS。高Hcy導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞合成NO減少，超氧陰離子、活性氧、羥自由基和脂質(zhì)過氧化物增多，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的氧化損害［5，6］。高Hcy促進低密度脂蛋白的氧化，生成氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，ox－LDL）［7］，ox－LDL易被巨噬細胞吞噬，巨噬細胞隨后轉(zhuǎn)變成泡沫細胞，導(dǎo)致脂質(zhì)條紋病變的產(chǎn)生和纖維斑塊的形成。高Hcy能引起許多炎癥介質(zhì)釋放，引起單核細胞、中性粒細胞對內(nèi)皮細胞的黏附，白細胞在粥樣斑塊中的聚集，導(dǎo)致AS的形成［8］。

5－LOX是催化花生四烯酸為白三烯類炎癥因子生成的關(guān)鍵限速酶，主要存在于內(nèi)皮細胞、多形白細胞、巨噬細胞等，特別在AS早期泡沫細胞中大量表達。用RT－PCR和免疫組織化學(xué)方法研究AS患者，發(fā)現(xiàn)5－LOX存在于人AS血管壁如主動脈、冠狀動脈及頸動脈，特別分布于CD68＋的巨噬細胞和泡沫細胞中［9］。在缺血綜合征患者的頸動脈斑塊區(qū)也發(fā)現(xiàn)了5－LOX的表達［10］。5－LOX在 AS發(fā)生發(fā)展的不同階段，包括內(nèi)皮損傷起始、斑塊形成及斑塊生長、損傷區(qū)細胞的增殖即斑塊不穩(wěn)定和斑塊破裂期，均發(fā)揮重要作用［11］。有癥狀A(yù)S斑塊不穩(wěn)定患者的斑塊巨噬細胞中5－LOX的存在與斑塊不穩(wěn)定性的病理形態(tài)學(xué)特征呈正相關(guān)，因此，5－LOX是斑塊破裂導(dǎo)致急性缺血事件的敏感標(biāo)志物［12］。在AS模型小鼠上，5－LOX激活蛋白（FLAP）在主動脈中上調(diào)最顯著，以FLAP抑制劑MK－886治療4周后，明顯降低斑塊面積，因此，5－LOX為AS的重要作用靶點［13］。

NO是一個重要的內(nèi)源性炎癥調(diào)節(jié)因子，通過減少Fe3＋轉(zhuǎn)化為Fe2＋，而滅活各種脂氧酶［14］。高Hcy導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞合成NO減少，此作用可以解釋本研究中，高Hcy導(dǎo)致兔主動脈5－LOX的表達增強。

普羅布考，又名丙丁酚，最初以降脂藥應(yīng)用于臨床。近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，普羅布考顯示出強大的抗動脈粥樣硬化的作用，普羅布考分子內(nèi)所含的酚羥基很容易被氧化而發(fā)生斷鏈，捕捉氧離子并與之結(jié)合形成穩(wěn)定的酚氧基，有效降低氧自由基濃度，從而預(yù)防或延遲動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，普羅布考可以通過其較強的抗氧化作用抑制該炎癥的發(fā)展［15］。

Ca2＋、FLAP及脂質(zhì)過氧化物能激活5－LOX。研究表明，在組織勻漿中，增加酶底物后，脂質(zhì)過氧化物可縮短5－LOX的間歇期，并且在白細胞中，能產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用的外界刺激能增強5－LOX活性［16］。脂質(zhì)過氧化物是不飽和脂肪酸鏈經(jīng)自由基或活性氧作用后形成帶有過氧基的脂質(zhì)。普羅布考能降低氧自由基濃度，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，因此，推測普羅布考可能通過減少脂質(zhì)過氧化物，從而抑制5－LOX。

研究觀察到給予高蛋氨酸飲食后兔主動脈5－LOX表達水平明顯升高，給予普羅布考治療后5－LOX表達水平明顯下降，同時主動脈組織形態(tài)明顯改善。綜上所述，普羅布考能減輕主動脈內(nèi)膜增生程度，具有抗AS的作用，該作用可能與其能抑制主動脈5－LOX表達有關(guān)。

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