張 毅 張 蕾 盧 偉 周春妮 蔣 林 陳林木譚川雪 王飛飛 晁鳳蕾 唐 勇＊

（1重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學教研室，2干細胞與組織工程教研室，400016，重慶）

阿爾茨海默氏病（Alzheimer disease，AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進行性認知和記憶功能障礙為主要特征。特征性病理改變?yōu)榧毎獯罅坷夏臧?、細胞?nèi)神經(jīng)原纖維纏結及神經(jīng)元死亡［1］。隨著全球人口老齡化，AD的發(fā)病率呈逐年上升，目前在世界范圍有超過3600萬人罹患AD，因日常生活能力進行性減退，嚴重危害老年人的身心健康并影響生存質(zhì)量，給家庭及社會帶來沉重的負擔，已成為嚴重的社會問題［2］。因此，對AD早期發(fā)病機制及預防的研究極為迫切。

以往的研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠的空間學習能力較年輕大鼠顯著性降低，而我們前期通過新的體視學方法研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠大腦內(nèi)毛細血管較正常青年大鼠顯著性下降，提示大腦內(nèi)毛細血管的老年改變與學習記憶和認知功能相關［3］。大腦毛細血管主要起調(diào)節(jié)大腦微環(huán)境、維持局部腦血流量等作用，而腦血管的病理改變在AD發(fā)病進程中起著極為重要的作用［4］。血管在大腦白質(zhì)內(nèi)分布較少，毛細血管的損傷勢必對白質(zhì)的結構和功能造成更大的影響。而大腦白質(zhì)結構的完整性與AD早期的認知功能下降有密切聯(lián)系［5］。那么AD早期是否存在大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管的改變呢？以往對AD大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管的研究較少，且多為定性或半定量研究及血管相關因子研究。迄今為止，國內(nèi)外尚未見關于AD動物白質(zhì)內(nèi)毛細血管準確定量研究的報道。因此，本研究將應用冰凍切片技術、免疫組織化學技術及體視學方法對大腦白質(zhì)的體積及白質(zhì)內(nèi)毛細血管的總長度、總體積及總表面積進行準確定量，以期準確認識AD大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管的形態(tài)改變。

材料和方法

1．實驗動物

隨機選取10月齡雄性Tg2576轉基因AD小鼠［6］和相同月齡同窩生野生型小鼠（Wild－type）各11只，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，正常飼喂。

2．Morris水迷宮

采用 DMS－2型電腦全自動程控 Morris水迷宮。水迷宮圓筒直徑為0．9m，高為0．5m，將圓桶等分為4個象限并設置4個入水點，將平臺隨機放入某一象限的中間，用牛奶將水染成白色與小鼠的深褐色和黑色形成對比色彩。整個測試包括定位航行實驗和空間探索兩個部分，為期七天［7，8］。前六天為定位航行試驗：將平臺隱藏在水下1－2cm，先將小鼠置于平臺上15s熟悉環(huán)境，然后將小鼠頭朝向池壁輕放入水，記錄小鼠的尋臺時間即逃避潛伏期，如果小鼠在60s內(nèi)未找到平臺，記錄時間60s，再置于平臺熟悉環(huán)境15s，每天每只小鼠共測試4個入水點。第7d為空間探索試驗：將平臺撤除，選擇兩個離平臺較遠端的入水點進行測試，記錄小鼠穿臺次數(shù)和目標象限游泳時間百分比。測試時水溫控制在20－22℃，保持周圍環(huán)境的安靜。每天的入水點順序均要隨機選擇，每個入水點均入水一次，每天的測試環(huán)境及平臺位置均要保持不變。

3．標本固定與取材

Morris水迷宮測試后，每組分別隨機選取7只小鼠給予1%戊巴比妥鈉（0．4ml／100g）進行腹腔麻醉，然后使用2% 的多聚甲醛和2．5% 的戊二醛混合固定液（pH 7．4）進行心臟灌流固定，固定后取出大腦。沿大腦縱裂將大腦左右半球分開，以冠狀方向切取1mm厚的連續(xù)腦組織切片（圖1A）。每側大腦半球平均切取8－10片，其中出現(xiàn)白質(zhì)的約7－8片。從每只小鼠隨機抽取一側大腦半球，用解剖顯微鏡將每一張腦片的枕側面放大拍照，計算白質(zhì)總體積。將等距測試點隨機疊加于所抽取大腦半球的腦片上，使大腦白質(zhì)內(nèi)各個部位的組織都有相同的概率被抽取，將與測試點重疊處的大腦白質(zhì)組織塊取出（約1mm3）（圖1B）。每只小鼠隨機選取5個白質(zhì)塊。

4．制作冰凍切片

用冰凍切片包埋劑OCT通過Isector包埋法［9］將白質(zhì)塊包成直徑為6mm的小球，讓小球在恒冷切片機滾動選擇垂直向上的一個方向切取厚度為4 μm的冰凍切片，貼在經(jīng)過1：5多聚賴氨酸處理的粘附載玻片上。將剛切過的標本取下，再次包埋成球形，選擇垂直向上的方向再次切取切片，重復包埋，切片4次。這種Isector二次包埋的方法可確保各個方向分布的毛細血管都有相同的概率被抽樣。每個組織塊共獲取4張切片，每個半腦共獲取20張切片。

5．免疫組織化學染色

將切片放入4℃丙酮固定10min。取出后用0．01mol／L PBS浸洗，每次浸洗5min，重復3次。接著用0．01mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6．0）在99℃下抗原修復10min，等其自然冷卻后，用0．01mol／L PBS浸洗，每次浸洗5min，重復3次。室溫下用3%過氧化氫50μl／片滴加至切片，37℃恒溫水浴箱孵育15min，用0．01mol／L PBS浸洗，每次浸洗5min，重復3次。正常山羊血清50μl／片進行血清封閉，37℃恒溫水浴箱孵育30min后傾去血清。滴加1∶500稀釋的大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體（Abcam，英國）50μl／片，抗體覆蓋組織邊緣2mm以上，4℃冰箱過夜。次日取出，37℃溫箱復溫30min后用0．01mol／L PBS浸洗，每次浸洗5min，重復3次。隨后加山羊抗鼠IgG 50μl／片37℃孵育30 min，0．01mol／L PBS浸洗，每次浸洗5min，重復3次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素50μl／片，37℃孵育30min，0．01mol／L PBS浸洗，每次浸洗5min，重復3次。DAB顯色后干燥，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

6．抽樣和圖像采集

用體視學設備，在4倍物鏡下圈定切片的邊界，于100倍油鏡下觀察，系統(tǒng)等距隨機選取白質(zhì)區(qū)域，每張切片共選取10個視野，每只動物白共選取200個視野。根據(jù)標尺將標記的所有血管中直徑≤10 μm的定義為毛細血管［10］并計數(shù)。

7．體視學分析

7．1大腦白質(zhì)體積 解剖顯微鏡拍照腦組織切片后，在每張1mm厚腦組織切片的尾側面隨機疊放透明的等距測點框，記數(shù)擊中白質(zhì)的測試點的個數(shù)（圖2A）。根據(jù)卡瓦列里原理［3，11，12］計算白質(zhì)總體積（Vwm）：

式中Vwm代表整個白質(zhì)的總體積，a（p）為每一測點所對應的面積（0．59mm2），t為切片厚度（1 mm），ΣP（wm）為擊中白質(zhì)的總測點數(shù)。

7．2毛細血管的總長度 在獲得的視野上隨機疊加無偏計數(shù)框，根據(jù)禁線法原則計數(shù)直徑≤10 μm血管斷面數(shù)Q（cap）（圖2B），根據(jù)下面公式計算得出白質(zhì)內(nèi)毛細血管的長度密度Lv（cap／wm）［11，12，13］：

式中ΣQ（cap）為被計數(shù)毛細血管斷面總數(shù)，ΣA為無偏計數(shù)框總面積。

然后根據(jù)下面公式計算毛細血管總長度L（cap，wm）：

7．3毛細血管的總體積 在體視學獲得的視野照片上隨機疊加等距測點，分別計數(shù)落在毛細血管斷面上的測試點數(shù)和落在整個視野上的測試點數(shù)（圖2C）。根據(jù)下面的公式計算白質(zhì)內(nèi)毛細血管的體積密度［12，13，14］：

式中Vv（cap／wm）為白質(zhì)內(nèi)毛細血管的體積密度，ΣP（cap）為落在毛細血管斷面上的總測點數(shù)，ΣP（wm）為落在整個視野上的總測點數(shù)。

根據(jù)下面的公式計算白質(zhì)內(nèi)毛細血管的總體積V（cap，wm）：

式中V（cap，wm）為毛細血管的總體積，Vv（cap／wm）為毛細血管的體積密度，Vwm為白質(zhì)的總體積。

7．4毛細血管的總表面積 在所得到的視野上隨機疊加相同長度的測試線，計數(shù)測試線與毛細血管交點的個數(shù)（圖2D）。根據(jù)下面計算白質(zhì)內(nèi)毛細血管的表面積密度Sv（cap／wm）和總表面積S（cap，wm）［3，12，14］：

式中Sv（cap／wm）為白質(zhì)內(nèi)毛細血管的表面積密度，ΣL為每個視野中所有測試線的總長度，ΣI（cap）為測試線與毛細血管交點的總數(shù)。

根據(jù)下面的公式計算白質(zhì)內(nèi)毛細血管的總表面積S（cap）：

式中S（cap，wm）為白質(zhì)內(nèi)毛細血管的總表面積，Sv（cap／wm）為白質(zhì)內(nèi)毛細血管的表面積密度，Vwm為白質(zhì)的總體積。

8．統(tǒng)計學處理

所有結果使用SPSS19．0統(tǒng)計軟件分析，Morrris水迷宮前6d的定位航行試驗數(shù)據(jù)采用重復測量的方差分析進行統(tǒng)計學計算，第7d的空間探索試驗采用單因素方差分析，體視學定量數(shù)據(jù)采用Student＇s t－test比較對照組和實驗組小鼠大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管各參數(shù)之間的是否有顯著差異，P＜0．05代表差異具有顯著性。

結 果

1．Morris水迷宮測試結果

在定位航行測試中，從第二天起，前二、三、四、五天及六天的潛伏期結果，10月齡Tg2576轉基因AD小鼠的逃避潛伏期顯著長于同月齡同窩生野生型小鼠，其p值結果分別為P＜0．01，P＜0．01，P＜0．01，P＜0．05，P＜0．01，而在空間探索試驗中，兩組的穿臺次數(shù)和目標象限游時間百分比均無顯著性差異 （P＞0．05）。（圖3）。

圖3 10月齡Tg2576轉基因AD小鼠和相應月齡野生型小鼠Morris水迷宮定位航行試驗潛伏期，每個點代表四次試驗潛伏期的平均值（Mean±SEM）＊P＜0．05。＊＊P＜0．01。Fig．3The escape latency of Morris water maze positioning navigation test in eleven 10－month－old transgenic AD mice and eleven 10－month－old non－transgenic littermates wild－type mice is shown．Each point represents the average of the four escape latencies （Mean±SEM）．＊P＜0．05．＊＊P＜0．01．

2．體視學分析結果

2．1 10月齡Tg2576轉基因AD小鼠與同月齡同窩生野生型小鼠毛細血管免疫組化染色形態(tài)學結果（圖4）。

2．2Tg2576轉基因AD小鼠大腦白質(zhì)的體積，白質(zhì)內(nèi)毛細血管總長度、總體積和總表面積

10月齡雄性Tg2576轉基因AD小鼠大腦白質(zhì)的體積（12．33±1．01mm3）與同月齡同窩生雄性野生型小鼠大腦白質(zhì)的體積（12．87±0．44mm3）相比沒有顯著差異 （P＞0．05）（圖5A）。10月齡雄性Tg2576轉基因AD小鼠大腦白質(zhì)毛細血管的總長度（6．90±0．82m）較同月齡同窩生雄性野生型小鼠（12．44±2．64m）顯著下降 （P＜0．01）（圖5B）。10月齡雄性Tg2576轉基因AD小鼠大腦白質(zhì)毛細血管的總體積（0．0648±0．0167mm3）較同月齡同窩生雄性野生型小鼠（0．0891±0．0145mm3）顯著下降 （P＜0．05）（圖5C）。10月齡雄性Tg2576轉基因AD小鼠大腦白質(zhì)毛細血管的總表面積（61．77±13．80mm2）較同月齡同窩生雄性野生型小鼠（106．81±20．17mm2）顯著下降 （P＜0．01）（圖5D）。

圖5A 10月齡Tg2576轉基因AD小鼠與同月齡同窩生野生型小鼠大腦白質(zhì)體積；5B：10月齡Tg2576轉基因AD小鼠與同月齡同窩生野生型小鼠大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管總長度；5C：10月齡Tg2576轉基因AD小鼠與同月齡同窩生野生型小鼠大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管總體積；5D：10月齡Tg2576轉基因AD小鼠與同月齡同窩生野生型小鼠大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管總表面積?！砭鶖?shù)值 ＊P＜0．05。＊＊P＜0．01。Fig．5AThe comparison of the white matter volume between 10－month－old Tg2576transgenic AD mice and 10－month－oldnon－transgenic littermates wild－type mice．5B：The comparison of the total length of the capillaries in the white matter between 10－month－old Tg2576transgenic AD mice and 10－month－old non－transgenic littermates wild－type mice．5C：The comparison of the total volume of the capillaries in the white matter between 10－month－old Tg2576transgenic AD mice and 10－month－old nontransgenic littermates wild－type mice．5D：The comparison of the total surface area of the capillaries in the white matter between 10－month－old Tg2576transgenic AD mice and 10－month－old non－transgenic littermates wild－type mice—indicates mean value． ＊indicates P＜0．05．＊＊indicates P＜0．01．

討 論

Tg2576轉基因AD模型小鼠表達淀粉樣前體蛋白（APP695），并且具有瑞典家族性老年癡呆突變。該模型小鼠存在一定程度的年齡相關的空間學習和記憶的損傷，因其在早期神經(jīng)元沒有大量丟失，能夠模擬AD早期輕度認知障礙的組織病理學改變［6］。所以在本研究中，我們選用該品系的轉基因AD小鼠來研究AD早期大腦的改變。Tg2576轉基因AD小鼠的記憶和認知功能相關的行為學改變與年齡相關［15］，因此我們需要通過行為學手段尋找Tg2576轉基因AD小鼠出現(xiàn)行為學改變的時間窗，Morrris水迷宮多用來研究與空間學習和記憶相關的腦功能，是目前最常用的一種評價動物學習和記憶能力的行為學實驗，本次行為學實驗中兩組小鼠Morris水迷宮定位航行測試結果顯示10月齡Tg2576轉基因AD小鼠的逃避潛伏期顯著長于同月齡同窩生野生型小鼠。本研究結果提示，10月齡Tg2576轉基因AD小鼠開始出現(xiàn)空間學習記憶能力障礙。

已有研究提示，在AD模型小鼠早期雖然存在Aβ大量沉積，認識、學習和記憶能力障礙，但并沒有大量神經(jīng)元死亡［16］。AD早期沒有神經(jīng)元死亡，那么AD早期出現(xiàn)的認知、學習和記憶能力下降的病理學基礎是什么呢？本研究把目光投向AD早期白質(zhì)內(nèi)毛細血管的改變。目前關于AD大腦內(nèi)毛細血管的研究提示，AD患者中病變β淀粉樣蛋白在血管平滑肌沉積；毛細血管網(wǎng)密度減少及出現(xiàn)線樣血管［17］；腦血管反應降低；毛細血管扭曲，特別是白質(zhì)內(nèi)毛細血管出現(xiàn)螺旋狀結構［18］。毛細血管的這些病理改變會導致大腦微循環(huán)障礙以及腦內(nèi)低灌注，引起Aβ蛋白沉積以及tau蛋白表達增加，而這些改變都與AD的形成密切相關。大腦白質(zhì)分布的毛細血管相對較少，白質(zhì)內(nèi)含有大量的神經(jīng)纖維對血供要求較高，因此更容易受到缺血缺氧性損傷，Medina等研究表明AD早期白質(zhì)的損傷與AD的發(fā)展相關［19］。因此van Norden提出血管對AD影響的假說，即血管相關危險因素累積使血管內(nèi)皮細胞損傷、血管密度降低和血管相關因子表達異常導致血管損傷后血流量降低，腦灌注不足，從而使大腦白質(zhì)病變，出現(xiàn)早期的學習記憶認知障礙，最終發(fā)展為AD［20］。但這些關于AD與白質(zhì)毛細血管的研究多限于定性研究，如Medina等對AD早期白質(zhì)的損傷的研究是通過影像學測定白質(zhì)FA值變化［19］。Leszek等通過測定低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRP1），血管相關因子VEGF及基因MEOX2等在AD中的變化對AD血管進行相關研究［21］。而毛細血管的定量研究較少，Bouras等根據(jù)微血管基膜免疫組織化學染色強度的大小來判斷血管基膜改變的程度［22］，Lee等通過 NADPH－d標記微血管然后計數(shù)血管個數(shù)及血管總長度［23］，但他們對大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管的定量研究采用的研究指標和方法均存在不足。毛細血管是不規(guī)則的線性結構，不能夠當做細胞等粒子進行計數(shù)，這樣計數(shù)結果是不準確的。以前對毛細血管長度研究時，他們沒有考慮白質(zhì)內(nèi)毛細血管分布與切片方向相對關系對結果的影響，在白質(zhì)內(nèi)毛細血管在各個方向的分布并不完全均勻。因此當研究白質(zhì)內(nèi)毛細血管長度時，需要運用球切法（Isector）［12］等體視學方法來保證實現(xiàn)三維空間內(nèi)均勻隨機的抽樣，從而使各個方向上分布的毛細血管有均等的機會被抽樣。

本實驗對10月齡Tg2576轉基因AD小鼠和同月齡野生型小鼠大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管進行體視學三維定量分析，實驗中采用CD31單克隆抗體標記血管內(nèi)皮細胞，因本實驗腦標本淋巴系統(tǒng)，經(jīng)過灌注后沒有血液，故CD31單克隆抗體在腦組織標記毛細血管具有特異性。且CD31具有很好的敏感性和特異性［24］。在方法學上，本研究所采用的方法比以往的相關研究使用的方法具有更多優(yōu)勢：1．在研究的區(qū)域內(nèi)均勻系統(tǒng)隨機抽樣，而非研究者主觀選擇的一些便于計數(shù)的“理想切片”。2．針對毛細血管長度、表面積的研究，采用了三維空間內(nèi)的均勻隨機抽樣的方法即Isector包埋法［9］。因此，使得各個方向上分布的毛細血管有均等的機會被抽取，保證了白質(zhì)內(nèi)毛細血管的各項指標無偏估計。3．研究結果得出的是毛細血管的絕對值，避免了“參照空間陷阱”問題?？傊狙芯繃栏褡裱瓱o偏體視學的各種抽樣原則，定量研究了AD轉基因小鼠大腦白質(zhì)毛細血管總長度、總體積和總表面積。這些數(shù)據(jù)將為以后運用這種動物模型做進一步的研究提供參考數(shù)值。本實驗結果顯示10月齡Tg2576轉基因AD小鼠白質(zhì)內(nèi)毛細血管的總長度、總體積和總表面積均較同月齡野生型小鼠顯著降低。這些結果均表明10月齡時Tg2576轉基因AD小鼠大腦白質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)毛細血管的改變，提示AD早期學習和記憶功能的缺失可能與大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管的改變相關。

本次實驗對10月齡轉基因AD小鼠大腦白質(zhì)進行體視學分析，結果顯示10月齡轉基因AD小鼠大腦白質(zhì)體積并沒有明顯減小。其原因可能是Tg2576小鼠在10月齡時行為學剛出現(xiàn)變化，還處于AD病變的早期階段，大腦白質(zhì)尚未出現(xiàn)明顯萎縮。而大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管較少，其總體積小于白質(zhì)總體積的6%，即使大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管體積的顯著降低也不足以引起白質(zhì)總體積的顯著改變。這也進一步提示10月齡轉基因AD小鼠大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管的改變可能較白質(zhì)其他結構早。因此我們推測在Tg2576轉基因AD小鼠行為學改變的早期，大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管改變可能是造成白質(zhì)損傷的重要原因。如果是這樣，我們就可以通過藥物或行為干預來逆轉大腦白質(zhì)內(nèi)毛細血管的丟失，從而防止白質(zhì)損傷，甚至延緩AD的進程。

圖 版 說 明

圖1A 連續(xù)的1mm大腦切片；

圖1B 在大腦切片上疊加等距測點，根據(jù)隨機落在白質(zhì)上的測點抽取組織塊，○所示為落在白質(zhì)上的測點；

圖2A 在大腦連續(xù)等距離切片上隨機疊加等距測點，記數(shù)擊中白質(zhì)的測試點的個數(shù)，標尺為500μm；

圖2B 在圖片上疊加無偏計數(shù)框，計數(shù)完全落在框內(nèi)且沒有排除線（紅線）接觸和僅與計數(shù)線（綠線）相交的毛細血管斷面數(shù)，☆所示為被計數(shù)的斷面標尺為10μm；

圖2C 在圖片上隨機疊加等距測試點，分別計數(shù)落在白質(zhì)和毛細血管斷面上的測點數(shù)標尺為10μm；

圖2D 在圖片上隨機疊加測試線，計數(shù)測試線與毛細血管的交叉點數(shù)，標尺為10μm；

圖4A 10月齡野生型小鼠白質(zhì)內(nèi)毛細血管；

圖4B 10月齡Tg2576轉基因AD小鼠白質(zhì)內(nèi)毛細血管。標尺為10μm

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1AOne of the successive 1mm cerebral slices；

Fig．1BThe point grid is randomly superimposed on the slice，and those points hitting the white matter are sampled．○shows the point hitting the white matter．

Fig．2APoint grid is randomly placed on successive equidistant brain slices，and the number of the points hitting the white matter are counted．＊Bar＝500μm．；

Fig．2B：An unbiased counting frame is randomly placed on the view of white matter，and the capillary profiles inside the counting frame and only crossing the counting lines（green lines）rather than the prohibitting lines（red lines）are counted．☆shows counted capillary profiles．＊Bar＝10μm．；

Fig．2C：Point grid is randomly placed on the view of white matter，and the number of the points hitting white matter and the number of points hitting capillaries are counted，respectively．＊Bar＝10μm；

Fig．2D：Test lines are put on the view of white matter，and the number of intersections between the test lines and capillary luminal surfaces are counted．＊Bar＝10μm．

Fig．4AThe capillaries in the white matter of 10－month－old non－transgenic littermates wild－type mice；

Fig．4B：The capillaries in the white matter of 10－month－old Tg2576transgenic AD mice．＊Bar＝10μm．

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