滕衛(wèi)軍 鄭曉娟 華宏軍 林峰

長鏈非編碼RNA UCA1在胃癌組織中的表達及其效應(yīng)分析

滕衛(wèi)軍 鄭曉娟 華宏軍 林峰

目的鉬分析胃癌組織特征長鏈非編碼RNA（lncRNA）表達譜，并探討長鏈非編碼RNA UCA1在胃癌中的表達及效應(yīng)。方法鉬采用基因芯片檢測6例胃癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織LncRNA表達水平，分析胃癌組織特征lncRNA表達譜，進一步通過定量PCR檢測40例胃癌及其對應(yīng)的癌旁正常組織中UCA1的表達并分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫塊大小、細胞分化程度及病理分期等臨床病理特征的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，利用siRNA下調(diào)AGS胃癌細胞內(nèi)UCA1表達水平，利用CCK-8試劑盒檢測UCA1干預(yù)對胃癌細胞增殖能力的影響。結(jié)果 LncRNA基因芯片檢測到胃癌組織1 021條差異＞2倍的lncRNA（P＜0.05），定量PCR驗證明顯差異表達的UCA1在胃癌組織中的表達顯著高于正常組織（P＜0.01）。此外，臨床病理相關(guān)分析顯示，UCA1表達水平還與胃癌的細胞分化程度及病理分期相關(guān)。分化低的胃癌組織中UCA1表達水平明顯高于中、高分化的胃癌組織（P＜0.05）；病理分期Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織的UCA1表達水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期的標(biāo)本（P＜0.05）。此外，下調(diào)UCA1胃癌細胞表達可明顯抑制細胞增殖。結(jié)論 異常表達的lncRNA參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，其中腫瘤組織上調(diào)表達的UCA1是胃癌重要的促癌基因。

胃癌 長鏈非編碼RNA 細胞增殖

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制尚未完全闡明。從分子水平闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展機制，將為尋求新的胃癌標(biāo)記物及有效的生物治療靶點提供新的思路。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA，它們本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上調(diào)控基因的表達水平[1-4]。lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳等多個層面參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程[1-4]。近年來人們開始關(guān)注lncRNA在各種生物學(xué)過程以及疾病中所起到的作用，尤其是癌癥[5-6]。有研究表明lncRNA與腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)高度相關(guān)[7]，但目前關(guān)于lncRNA在胃癌中的研究尚停留在起步階段?，F(xiàn)我們采用lncRNA基因芯片檢測胃癌組織及癌旁正常組織lncRNA的表達水平，篩選胃癌組織特征lncRNA表達譜，在此基礎(chǔ)上選擇胃癌組織上調(diào)最明顯的UCA1（LINC00178），通過定量PCR進行驗證，并通過體外干預(yù)實驗，分析其對胃癌細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗標(biāo)本 40例胃癌組織及配對癌旁正常組織標(biāo)本來自2008-2012年在兩家醫(yī)院行手術(shù)治療的胃癌患者?；颊咝g(shù)前均未行放、化療，年齡42～80歲，中位年齡65歲；組織病理類型的判斷參照WHO胃癌的病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，TNM分期參照UICC/AJCC 2002年標(biāo)準(zhǔn)。每例標(biāo)本留取腫瘤組織及對應(yīng)的距腫瘤5cm以上的癌旁正常胃黏膜組織（經(jīng)組織病理切片檢測證實），離體后10min內(nèi)置于液氮中保存待做后續(xù)分析。

1.2 材料和試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；DNase I、RNase-free試劑購自美國Thermo公司；ReverTra AceRqPCR RT Kit、SYBRRGreen Realtime PCR Master Mix等購自日本Toyobo公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自日本同仁研究所；人胃癌AGS細胞購自中科院上海細胞庫；Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0芯片購自上海康成生物技術(shù)有限公司；LncRNAsiRNA和Negative Control由上海吉瑪公司合成；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA的提取 取液氮保存的胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本，在液氮中碾碎至粉狀，按Trizol試劑說明書提取總RNA，DEPC處理過的蒸餾水溶解。為去除可能污染的DNA，抽提的RNA溶液按DNase I說明書步驟進一步純化。采用NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）檢測RNA溶液OD260/OD280，計算RNA濃度和純度，OD260/OD280比值＞1.8方可用于檢測。1.0%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3.2 胃癌組織lncRNA表達譜檢測 抽提6例胃癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織的RNA，根據(jù)Arraystar Human lncRNA Microarray V3.0芯片檢測的說明書，檢測30 586條lncRNA的表達，選擇差異倍數(shù)＞2，P＜0.05的lncRNA，采用非監(jiān)督等級聚類方法分析胃癌組織特征lncRNA表達譜。

1.3.3 lncRNA UCA1表達分析 以GAPDH作為內(nèi)參，分析UCA1表達。相關(guān)分析的引物序列見表1。2μg總RNA按照ReverTraAcerTqPCR RT Kit說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。以20μl反應(yīng)體系進行real-time PCR。定量PCR檢測反應(yīng)體系包括：1μl RT產(chǎn)物，1×SYBR Green IMaster mix，10μmol/L特異前向引物、10μmol/L特異反向引物。real-time PCR條件為：95℃ 5min后，94℃ 15s，60℃1min，72℃30s，40個循環(huán)。所有樣品做3復(fù)孔。realtime PCR使用Bio-Rad CFX96儀器進行。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-ΔΔCt表示標(biāo)本中CXCL14相對表達量，其中△△Ct=（CtUCA1-CtGAPDH）腫瘤-（CtUCA1-Ct－GAPDH）正常。

表1 定量PCR檢測相關(guān)引物序列

1.3.4 細胞增殖與活性檢測 AGS胃癌細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，37℃條件下培養(yǎng)、傳代。每2～3d傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。為分析UCA1干預(yù)對細胞增殖與活性的影響，我們進一步采用siRNA干預(yù)胃癌細胞UCA1表達，1×105細胞/100μl接種96孔板，以20、40、80nM等濃度的 UCA1siRNA，按照 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染細胞，同時設(shè)未轉(zhuǎn)染空白對照及陰性對照。參照CCK-8試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀測定在450nm處的OD值，檢測細胞相對活性=實驗組OD值/空白對照組OD值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料采用中位數(shù)（四分位間距）表示，UCA1在胃癌及其配對癌旁組織表達水平比較采用配對的非參數(shù)Wilcoxon符號秩檢驗；胃癌組織UCA1相對表達水平與胃癌臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系采用Mann-Whitney U檢驗（兩組）和Kruskal-Wallis H檢驗（多組）進行分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織lncRNA表達譜分析 6例胃癌組織及其配對的癌旁正常組織30 586條lncRNA中，與癌旁正常組織相比，1 021條lncRNA在胃癌組織的表達差異倍數(shù)＞2（P＜0.05），其中611條lncRNA明顯上調(diào)，410條lncRNA明顯下調(diào)。上調(diào)和下調(diào)表達最明顯的10條lncRNA見表2。

表2 胃癌組織差異表達最明顯的lncRNA

2.2 UCA1表達水平在胃癌組織中表達的驗證及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 在上述芯片篩選的胃癌組織特征lncRNA表達譜中，UCA1（LINC00178）上調(diào)表達最明顯，與癌旁正常對照比較，胃癌組織中表達上調(diào)達28.28倍。采用定量PCR分析對40例胃癌及其配對癌旁組織UCA1表達水平也進一步證實芯片篩選的結(jié)果（圖1），采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 UCA1在胃癌及其配對癌旁組織中的表達

進一步分析UCA1表達水平與胃癌臨床病理特征的關(guān)系顯示，UCA1的表達水平在不同細胞分化程度及病理分期存在統(tǒng)計學(xué)差異,低分化胃癌組織的UCA1表達水平明顯高于中高分化的標(biāo)本（P＜0.05）；病理分期Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織的UCA1表達水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期的水平（P＜0.05）。UCA1的表達水平和性別、年齡、腫塊位置、腫塊大小、腫塊侵襲深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)（均P＞0.05），見表3。

2.3 下調(diào)UCA1表達對胃癌細胞增殖的影響 見圖2。由圖2可見，與空白對照、陰性對照比較，20、40及80nM濃度的UCA1 siRNA干預(yù)實驗組細胞增殖均明顯受到抑制（均P＜0.05）。

3 討論

在后基因組時代，RNA組學(xué)研究逐漸成為熱點：基因組超過98%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為不編碼蛋白的非編碼RNA，lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA，它們本身并不編碼蛋白，起初lncRNA被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，近年越來越多的研究表明，lncRNA可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機體生理、病理過程而受到關(guān)注。lncRNA通常分為5類：即正義（Sense）、反義（Antisense）、雙向（Bidirectional）、基因內(nèi)（Intronic）及基因間（Intergenic）lncRNA[8]。目前發(fā)現(xiàn)lncRNA與很多的臨床意義。

表3 UCA1表達水平與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

本研究利用lncRNA基因芯片檢測6例胃癌組織及其配對的癌旁正常組織lncRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)了1 021條在胃癌組織異常表達lncRNAs，其中l(wèi)incRNABBOX1-2、CR594506及UCA1等lncRNA已被證實[18]。利用（http://www.ebiomed.org/ncFANs/or http://www.noncode.org/ncFANs/）提供的ncFANs（non-coding RNA Function Annotation Server）網(wǎng)絡(luò)界面分析也顯示，多條lncRNA也與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[19-20]。定量PCR分析也進一步驗證了上調(diào)最明顯的UCA1（LINC00178）長鏈非編碼腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已成為腫瘤研究的新方向[8-9]。

圖2 UCA1siRNA干預(yù)對AGS胃癌細胞細胞增殖的影響（A：siRNA干預(yù)胃癌細胞對UCA1表達影響；B：UCA1 siRNA干預(yù)對AGS胃癌細胞增殖的影響。與空白對照及陰性對照比較，*P＜0.05）

近年來的研究表明，lncRNA在腫瘤中非常敏感，是腫瘤特異標(biāo)記物，同時，lncRNA也可以作為腫瘤治療的分子靶點[10-12]。例如，lncRNA與結(jié)腸直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可通過DNA甲基化、組蛋白修飾等多種途徑參與結(jié)腸直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程[13-14]。HULC已經(jīng)被鑒定出在肝癌及腸癌肝轉(zhuǎn)移的組織中特異性高表達，是臨床肝癌的診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)記[10]。在原發(fā)乳腺癌腫瘤中HOTAIR表達增高，并且HOTAIR表達水平是原發(fā)乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移和患者死亡的獨立的預(yù)后因素[11]。而且，siRNA干擾HOTAIR表達，能夠明顯抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，表明HOTAIR可以作為診斷和治療的重要靶點[11]。此外，lncRNA的表達與腫瘤的化療敏感性有關(guān)，沉默lncRAN表達能顯著增加順鉑或甲烯氧四環(huán)素誘導(dǎo)的細胞凋亡，從而增加化療敏感性[12]。但LncRNA與胃癌相關(guān)的研究尚為數(shù)不多。Cao等[15]利用GEO數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)胃癌組織71條上調(diào)、17條下調(diào)表達的lncRNA。Lin等[16]利用LncRNA芯片檢測也發(fā)現(xiàn)了胃癌組織2 621條差異表達的lncRNA。Song等[17]也發(fā)現(xiàn)了135個差異表達lncRNA，并探討了H19及uc001lsz RNA，提示其和胃癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。

UCA1屬于基因間lncRNA，長度2 314bp，定位于19號染色體p13.12區(qū)域。已經(jīng)證實，UCA1上調(diào)表達可影響大腸癌細胞增殖、凋亡和細胞周期分布[21]，并與黑色素瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)[22]。最近Li等[23]也發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細胞癌UCA1過表達與預(yù)后不良相關(guān)。本研究分析UCA1表達水平與胃癌臨床病理特征的關(guān)系顯示，UCA1的表達水平與細胞分化程度及病理分期相關(guān)，而且，下調(diào)UCA1胃癌細胞表達可明顯抑制細胞增殖，進一步提示UCA1也是胃癌重要的促癌基因。已經(jīng)證實，UCA1可通過mTOR-STAT3/microRNA143途徑上調(diào)己糖激酶2（hexokinase 2）促進腫瘤細胞糖代謝[24]，并可通過抑制p27（Kip1）表達促進乳腺腫瘤生長[25]。此外，UCA1還可通過CREB及PI3-K依賴的途徑調(diào)控膀胱癌細胞周期分布[26]。UCA1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的機制有待于進一步研究。

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Expression of long non-coding RNA UCA1 in gastric carcinoma tissue

TENG Weijun,ZHENG Xiaojuan,HUA Hongjun,et al.De-partment of Gastroenterology,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Objective To investigate the p rofiles of long non-cod ing RNA(lncRNA)exp ression in gastric cancer tissue.Methods The exp ression of lncRNAs was detected w ith m icroarray assay in 6 sam p les ofgastric tumor and matched adjacent tissues.The p rofiles of lncRNAs in gastric cancer tissues were identified.The UCA1 exp ression was evaluated by real-time reverse transcrip tion polymerase chain reaction(RT-PCR)in 40 gastric tumor sam p les and matched ad jacent tissues. The correlations of UCA1 exp ression w ith lym ph node metastasis,tumor size,celld ifferentiation,pathologicalstage were further analyzed.Tumor cellp roliferation was assessed follow ing siRNA knockdown of UCA1 by using the CCK 8 kits.Results A total of1 021 lncRNA exp ressed in gastric tumor sam p les＞2 folds thanmatched ad jacent tissues were identified(P＜0.05)using m icroarray assay.RT-PCR showed that the exp ression of UCA1 was significantly highly in gastric cancer than that in ad jacent tissues(P＜0.0001).High UCA1 exp ression was associated w ith celldifferentiation and pathologicalstage ofgastric cancer.UCA1 exp ression in low-d ifferentiated gastric cancerwas significantly higher than that in w ith high-d ifferentiated cancer(P=0.031).In add ition,UCA1 level in stageⅢ/Ⅳgastric cancerwas significantly higher than thatw ith stage I/IIcancer(P=0.013).Furthermore, inhibition of UCA exp ression supp ressed the p roliferation of gastric cancer cells.Conclusion Abnormalexp ression of LncRNA may be involved in the development of gastric cancer.Up-exp ression of UCA1 in tumor tissue m ight act as an oncogene and p romote the developmentofgastric cancer.

Gastric cancer Long non-cod ing RNA Cellp roliferation

2014-12-22）

（本文編輯：沈昱平）

金華市科技局重點課題項目(2012-3-006)；臺州市科技局項目（1301ky40）

321000金華市中心醫(yī)院消化內(nèi)科（滕衛(wèi)軍、鄭曉娟、華宏軍）；臺州市第一人民醫(yī)院普外科（林峰）

林峰，E-mail：linfeng2316@sina.com