■王亞軍 王 露 王德培，2

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Tem?perature Plasma，ARTP)是近幾年發(fā)展起來的一種等離子體源，能夠在常溫、常壓下產(chǎn)生高活性粒子濃度的等離子體射流。其中的活性粒子作用，使微生物細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著改變，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生突變。研究表明，ARTP對細(xì)菌、真菌等多種微生物具有良好的誘變效果。與傳統(tǒng)誘變方法相比，采用ARTP誘變處理能夠有效造成DNA多種損傷，突變率高，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株。Wang等系統(tǒng)研究了ARTP對于DNA、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞的作用效果及其機(jī)理，將其應(yīng)用于阿維鏈霉菌的誘變，成功獲得了阿維菌素產(chǎn)量提高菌株，證明了ARTP用于微生物誘變育種的有效性。近年，利用ARTP誘變選育高產(chǎn)菌株的報道也越來越多，鄭明英等利用ARTP系統(tǒng)誘變嗜醋酸棒桿菌篩選出一株產(chǎn)脯氨酸突變株，使脯氨酸產(chǎn)量提高20.3%。薛剛等采用ARTP誘變1株產(chǎn)高溫蛋白酶的地衣芽胞桿菌，選育出1株高產(chǎn)突變株Bacillus licheniformis TP1-5，產(chǎn)酶活力達(dá)到了33 200 U/ml，為出發(fā)菌株的1.56倍。

解淀粉芽胞桿菌在其自身的生長過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，部分是一些抗生素，主要包括氨基酸類、肽類、脂肽類、磷脂類、多烯類、核酸類物質(zhì)，對多種動、植物病原菌有很好的抑制作用，并且可作為根系細(xì)菌促進(jìn)植物生長。因此，近些年，人們在芽胞桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化方面做了大量探索，并希望通過提高發(fā)酵水平，獲得大量芽胞桿菌菌體或代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物防治和用于食品防腐領(lǐng)域，以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。本研究利用ARTP誘變系統(tǒng)對解淀粉芽胞桿菌BI2進(jìn)行誘變，以期獲得其高產(chǎn)抑菌性次級代謝產(chǎn)物的突變菌株，為菌株進(jìn)一步應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BI2由本實驗室自青貯秸稈中分離得到，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號：CGMCC No.3413；黃曲霉(Aspergillus flavus)，黑曲霉(Aspergillus niger)均由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院生化工程研究室保存。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(g/l)：牛肉膏5.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0，pH值7.2～7.4；固體培養(yǎng)基加20.0 g瓊脂，1×105Pa滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：稱取馬鈴薯200 g，切成小塊，加1 000 ml蒸餾水煮沸30 min，雙層紗布過濾，濾液加水至1 000 ml，加入20 g葡萄糖，pH自然，1×105Pa滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：牛肉膏 5.0、可溶性淀粉 5.0、玉米漿12.0、NaNO312.0、NaCl 5.0、吐溫80 0.6、谷氨酸鈉20.0，pH值7.5，1×105Pa滅菌20 min。

1.2 ARTP系統(tǒng)誘變方法

取在肉湯培養(yǎng)基中經(jīng)7 h培養(yǎng)的解淀粉芽胞桿菌BI2菌液，離心，沉淀用無菌生理鹽水洗滌，稀釋5倍后測600 nm處OD值(0.6～0.8)，取10 μl稀釋后的菌液加到特制金屬片上，利用思清源生物科技生產(chǎn)的常壓室溫等離子體育種機(jī)(ARTP)進(jìn)行菌株誘變。本研究采用氦氣作為工作氣體，ARTP操作條件如下：輸入功率：120 W，照射間距：2 mm，氣流量：10 L/min，處理時間：10、20、25、30、35、40、50、70、90 s。對照未誘變原始菌株。使用微量活菌計數(shù)法統(tǒng)計誘變時間對BI2致死率的影響。

1.3 分析方法

1.3.1 BI2培養(yǎng)和處理方法

從BI2斜面上挑取菌苔接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，按2%的接種量接入新鮮肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，再以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)36 h后，經(jīng)10 000 r/min離心20 min，取上清作為抑菌物質(zhì)發(fā)酵液。

1.3.2 初篩

利用菌株拮抗產(chǎn)生抑菌圈的方法，指示菌有黑曲霉和黃曲霉可供選擇。將霉菌接種在PDA斜面上，35℃培養(yǎng)5 d，取一環(huán)孢子到1 ml生理鹽水中，震蕩搖勻并用血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌漏斗濾去菌絲殘體，稀釋到孢子濃度為5×105cfu/ml，取100 μl孢子懸液涂布至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基平皿上，同時將ARTP處理后的金屬片置于1 ml生理鹽水中，震蕩后將菌體洗下制成芽胞桿菌懸液，梯度稀釋，各稀釋度取100 μl涂布到上述已預(yù)涂孢子懸液的肉湯培養(yǎng)基平皿上，與兩種霉菌共培養(yǎng)，35℃培養(yǎng)36 h后觀察并記錄比較抑菌圈和菌落直徑比值大小。

1.3.3 復(fù)篩

通過對比黃曲霉孢子萌發(fā)數(shù)計算抑菌率的方法。如1.3.2方法制備黃曲霉孢子懸液，孢子濃度為5×104cfu/ml。取BI2除菌發(fā)酵液與滅過菌未凝PDA培養(yǎng)基按1∶6比例混合，搖勻倒入平皿中，培養(yǎng)基凝固后分別涂布100 μl上述黃曲霉孢子懸液，用空白PDA培養(yǎng)基做對照，30℃培養(yǎng)36 h后進(jìn)行孢子萌發(fā)計數(shù)，計算抑制率，每組做3個平行。

抑菌率計算方法：孢子萌發(fā)抑制率(%)=100×(對照組孢子萌發(fā)數(shù)-實驗組孢子萌發(fā)數(shù))/對照組孢子萌發(fā)數(shù)。

1.3.4 遺傳穩(wěn)定性實驗

將經(jīng)過篩選得到的正突變程度較大的菌株在營養(yǎng)肉湯斜面培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)10代，后將各代菌株接種于肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液抑菌活性。

2 結(jié)果

2.1 誘變時間對芽胞桿菌BI2致死率的影響

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期中期的BI2菌株經(jīng)離心洗滌后在不同時間下進(jìn)行ARTP誘變，圖1表明，ARTP處理對BI2的致死作用較強(qiáng)，25 s后致死率達(dá)到90%以上；處理90 s以上致死率達(dá)到100%。由現(xiàn)代育種理論可知，當(dāng)微生物菌種的致死率在90%～95%范圍時正突變率最高，因此從處理時間為25、30、35、40 s的菌株中進(jìn)行初步篩選。

2.2 初篩

誘變處理后的芽胞桿菌BI2，分別涂布于表層涂有兩種霉菌孢子的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)36 h。其中黑曲霉做指示菌時（見圖2A）形成的抑菌圈較大可準(zhǔn)確測量，黃曲霉做指示菌時（見圖2B）形成的抑菌圈較小，不易觀察比較和準(zhǔn)確測量，因此選擇黑曲霉作為指示菌篩選抑菌能力強(qiáng)的芽胞桿菌菌株。

圖1 芽胞桿菌BI2ARTP處理致死曲線

圖2 芽胞桿菌初篩形成抑菌圈

從4個處理時間的菌株初篩平皿上共892個菌落中挑選出產(chǎn)抑菌圈的菌落共621株，再將其分別點種于黑曲霉孢子混合培養(yǎng)皿上共培養(yǎng)36 h，再篩選一次，挑選出抑菌圈與菌落直徑比值較大的菌共16株，計算4個不同處理時間的菌株正突變率。表1可見：菌株正突變率最高時，誘變處理時間為30 s，根據(jù)圖1，此時芽胞桿菌BI2致死率為92.1%。

表1 不同處理時間芽胞桿菌BI2的正突變率

第二輪初篩結(jié)果見圖3，由圖3可知：16株菌的抑菌圈直徑與菌落直徑比值均高于出發(fā)菌株，但16株菌之間沒有明顯差異，因此需進(jìn)行復(fù)篩實驗。

圖3 抑菌圈與菌落直徑比

2.3 復(fù)篩

將此16株菌經(jīng)肉湯培養(yǎng)基平板分離純化，挑取單菌落接種到液體肉湯培養(yǎng)基活化培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，后測定抑菌活性，抑菌效果見圖4，圖4A中培養(yǎng)基內(nèi)沒有抑菌物質(zhì)，黃曲霉菌落較大，菌絲蔓延較廣，氣生菌絲生長旺盛。圖4B中培養(yǎng)基內(nèi)按BI2發(fā)酵液：PDA培養(yǎng)基（v/v）=1∶6，因發(fā)酵液中含抑菌物質(zhì)，黃曲霉孢子萌發(fā)受到抑制，萌發(fā)的菌落數(shù)減少；同時菌落生長也受到抑制，因此菌落較小。

計算抑菌率結(jié)果見圖5，突變株No.3、No.11、No.12、No.13和No.14具有較高的抑菌活性，與出發(fā)菌種(CK)相比，抑菌率分別提高了26.1%、21.7%、23.5%、26.1%和26.9%。因此，選擇這幾株突變株進(jìn)行下一步遺傳穩(wěn)定性的研究。

2.4 遺傳穩(wěn)定性實驗

遺傳穩(wěn)定性實驗中將出發(fā)菌株和突變株在肉湯培養(yǎng)基斜面中連續(xù)培養(yǎng)10代，取第1代，第3代，第6代，第8代和第10代的菌種進(jìn)行發(fā)酵，并與出發(fā)菌株(CK)進(jìn)行比較，結(jié)果見表2，No.12菌多代菌株間的抑菌率均能穩(wěn)定保持在75%以上，且平均比出發(fā)菌株抑菌率高22.7%，任意兩代之間差異均不超過10%，表明菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)性能穩(wěn)定，未出現(xiàn)回復(fù)突變情況，所以選擇No.12菌株作為后續(xù)實驗出發(fā)菌株，命名為BI2-12。

圖4 復(fù)篩時發(fā)酵液的抑菌圈

圖5 復(fù)篩抑菌率

表2 傳代后菌株的抑菌率(%)

3 討論

解淀粉芽胞桿菌BI2是一株廣譜拮抗菌，能抑制20多種真菌和細(xì)菌，尤其對霉菌具有很強(qiáng)的抑制能力，能夠產(chǎn)生兩種抑菌物質(zhì)（其中一種已鑒定出是surfactin，另一種待鑒定），分別對菌絲生長和孢子萌發(fā)有抑制作用。因此，對其進(jìn)行誘變處理后篩選出高產(chǎn)抑菌物質(zhì)的菌株對于充分開發(fā)菌株抑菌能力具有重要意義。

目前關(guān)于采用ARTP系統(tǒng)誘變芽胞桿菌的報道不多，蔡聰?shù)壤玫入x子體誘變育種技術(shù)誘變凝結(jié)芽胞桿菌篩選出一株木糖耐受力強(qiáng)、L-乳酸產(chǎn)量高的菌株，其L-乳酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高21.51%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高16.00%。Guo等利用等離子體誘變篩選出一株拜氏梭菌，提高了菌株的丙酮，丁醇和乙醇產(chǎn)量，大大縮短了發(fā)酵時間。另外，關(guān)于芽胞桿菌以霉菌作為指示菌通過抑菌圈篩選的研究也較少，王瑞霞等[利用亞硝基弧(NTG)和微波誘變的方法隨機(jī)篩選出兩株芽胞桿菌突變株，其抑菌圈直徑分別比出發(fā)菌株提高了21.8%和14.8%。但這種方法的工作量很大，而且效果不顯著。盧艷回等利用紫外和亞硝基弧兩次誘變，采用瓊脂擴(kuò)散抑菌圈法篩選出一株高產(chǎn)菌株，其抑菌活性比出發(fā)菌株提高了80%。但這種方法不夠精確，誤差較大。本實驗以解淀粉芽胞桿菌BI2為實驗菌進(jìn)行ARTP誘變，通過實驗比較后確定由黑曲霉做指示菌，通過比較抑菌圈與菌落比值的方法初篩，快速獲得正突變程度高的菌株。復(fù)篩選取黃曲霉作為指示菌計算孢子萌發(fā)抑菌率的方法進(jìn)行篩選，準(zhǔn)確高效，篩選后經(jīng)過遺傳穩(wěn)定性實驗，獲得一株能夠穩(wěn)定高產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的芽胞桿菌BI2-12。此株菌發(fā)酵液抑菌率能在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上平均提高22.7%。

4 結(jié)語

本研究通過開發(fā)用黑曲霉做指示菌產(chǎn)生抑菌圈的篩選方法，為以后芽胞桿菌的篩選提供了思路，通過誘變選育也為進(jìn)一步開發(fā)其潛力奠定了基礎(chǔ)。

（參考文獻(xiàn)19篇，刊略，需者可函索）