林紅霞 戴東波 丁玎 王茜

高效液相色譜法同時測定阿霉素/姜黃素載雙藥納米粒的藥物含量及包封率

林紅霞 戴東波 丁玎 王茜

目的 建立采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定阿霉素/姜黃素載雙藥納米粒（DOX/CUR-NPs）中阿霉素和姜黃素的含量及包封率的方法。方法 采用乳化溶劑揮發(fā)法制備DOX/CUR-NPs；按照制劑含量測定方法學(xué)要求考察所建立HPLC法的專屬性、精密度、回收性等，并結(jié)合超速離心法測定DOX/CUR-NPs的包封率。結(jié)果 成功制備了DOX/CUR-NPs；在建立的色譜條件下，DOX和CUR專屬性好，精密度、回收率、重復(fù)性等試驗均符合方法學(xué)要求。兩藥在0.5～50.0μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999），納米粒中DOX與CUR的包封率分別為（58.9±1.11）%和（75.4±1.76）%。結(jié)論 HPLC法準(zhǔn)確可靠、簡單快速，可用于DOX/CUR-NPs的藥物含量及包封率的同時測定。

阿霉素 姜黃素 載雙藥納米粒 含量測定 高效液相色譜

鹽酸阿霉素（DOX）屬水溶性蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，其抗癌譜廣、活性強(qiáng)、療效確切，但其耐藥現(xiàn)象（MDR）普遍[1]，限制了其在臨床上的應(yīng)用。姜黃素（CUR）是姜黃屬中藥的主要藥理成分，能抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖，下調(diào)P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白1和乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白，以多途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，是一種極具開發(fā)前景的MDR中藥逆轉(zhuǎn)劑[2-3]。筆者在研制鹽酸阿霉素/姜黃素載雙藥納米粒（DOX/CUR-NPs）的過程中，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的研究多為分開測定兩藥的含量，操作繁瑣，耗時耗力[4-5]。因此，本研究建立了一種同時測定納米粒中DOX、CUR藥物含量的高效液相法，用于制劑優(yōu)化過程中包封率、載藥量的定量測定，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 DOX為浙江海正制藥有限公司贈予；姜黃素購自成都普思生物技術(shù)有限公司；DOX、CUR標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國藥品生物制品檢定所；mPEG-PLA購自山東岱罡生物科技有限公司；PVA購自百靈威科技有限公司；乙腈、甲醇均購自美國Honeywell Burdick&Jackson公司。Agilent1200高效液相色譜儀購自美國Agilent公司；OptimaMAX超速離心機(jī)購自美國Beckman公司；99-ⅡDN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司；CP225D電子天平購自德國賽多利斯公司。

1.2 方法

1.2.1 DOX/CUR-NPs及空白NPs的制備 精密稱取10 mg的DOX溶于1ml雙蒸水，混勻，吸取100μl構(gòu)成內(nèi)水相；精密稱取5mg的CUR和50mg的mPEG-PLA，溶于2ml二氯甲烷-丙酮（3∶2）混合溶劑中，構(gòu)成有機(jī)相；內(nèi)水相與有機(jī)相混合后，冰浴中間歇式超聲（300W，60s）得到初乳；另量取4ml 3%的PVA水溶液，構(gòu)成外水相；初乳與外水相混合后，冰浴中間歇式超聲（400W，60s）得到復(fù)乳；將此復(fù)乳緩慢滴加至高速磁力攪拌下的20ml 0.5%PVA水溶液中，滴畢，繼續(xù)攪拌10min，室溫減壓蒸去有機(jī)溶劑和部分水，得到帶桔黃色乳光的納米?；鞈乙海―OX/CUR-NPs）。按上述方法，僅不加DOX與CUR，制備空白NPs混懸液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：以乙腈為A相，以0.02 mol/L磷酸二氫鈉（磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）為B相，梯度洗脫：0～6min，30%A；6～7min，30%～60%A；7～15 min，60%A；體積流量1.0ml/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量20 μl，檢測波長：0～7min，233nm；7～15min，425nm。

1.2.3 溶液的制備 分別精密稱取DOX對照品、CUR對照品各10mg置于50ml棕色量瓶中，甲醇溶解，并稀釋至刻度，制成DOX、CUR質(zhì)量濃度各為200μg/ml的對照品儲備液。分別精密量取DOX、CUR對照品儲備液各25ml置50ml棕色量瓶中，混勻，即為DOX、CUR質(zhì)量濃度各為100μg/ml的混合對照品儲備液。精密量取制備的DOX/CUR-NPs混懸液1ml于10ml棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲，0.22μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。精密量取制備的空白納米?；鞈乙海瓷鲜龉┰嚻啡芤旱闹苽浞ú僮?，即得空白納米粒對照液。

1.3 專屬性考察 分別量取20μl“1.2.3”項下DOX對照品儲備液、CUR對照品儲備液、混合對照品儲備液、空白納米粒對照液和供試品溶液，按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，考察儀器專屬性。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取20μl混合對照品儲備液置于10ml棕色量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.5、5、10、25、50 μg/ml的系列混合對照品溶液，按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，以峰面積A對質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.5 精密度試驗 取低（0.5μg/ml）、中（5μg/ml）、高（50μg/ml）3個濃度的混合對照品溶液，按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別于1d內(nèi)測定5次，連續(xù)測定5d，計算得日內(nèi)和日間精密度。

1.6 回收率試驗 吸取同一批次制備的空白納米粒混懸液1ml于10ml棕色量瓶中，分別精密加入混合對照品溶液適量，用甲醇稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為低（0.5μg/ml）、中（5μg/ml）、高（50μg/ml）3個濃度的樣品溶液（各濃度樣品平行制備3份）。經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，每個濃度平行操作3次，計算得DOX、CUR的回收率。

1.7 重復(fù)性試驗 取同一批次制備的DOX/CUR-NPs混懸液平行制備6份供試品溶液，按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批次制備的DOX/CUR-NPs供試品溶液，分別于0、2、4、8、6、12、24h按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算RSD。

1.9 超速離心回收率試驗 精密量取混合對照品儲備液1ml至10ml棕色量瓶中，空白納米?；鞈乙合♂屩量潭?，配制成含DOX、CUR均為0.5、5、50μg/ml的溶液，各3份。精密量取各溶液4ml置于離心管中，封口，超速離心（4℃，40 000r/min，60min）后，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算超速離心回收率。

1.10 納米粒中藥物的含量測定 精密量取 DOX/ CUR-NPs混懸液1ml于10ml棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲，0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)3次，計算得藥物含量。

1.11 包封率的測定 精密量取DOX/CUR-NPs混懸液4ml于具塞離心管中，超速離心（4℃，40 000r/min，60min）后，取上清液1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算游離DOX、CUR含量，分別記作W1、W2；另精密量取DOX/CUR-NPs混懸液1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“1.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算納米?；鞈乙褐锌偟乃幬锖?，記作W3、W4。按下式計算納米粒的包封率：

包封率（DOX）%＝（W3-W1）/W3×100%包封率（CUR）%＝（W4-W2）/W4×100%

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 DOX對照品儲備液、CUR對照品儲備液、混合對照品儲備液、空白納米粒對照液和供試品溶液的高效液相色譜圖見圖1。

由圖1可知，DOX、CUR色譜峰峰型良好，輔料和溶劑對藥物測定無干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 試驗重復(fù)6次，計算得DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=83.994C-8.8053，CUR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A= 191.07C+56.769，表明DOX、CUR濃度在0.5～50 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，詳見圖2。

圖1 高效液相色譜圖（A：空白NPs；B：DOX/CUR對照品；C：DOX對照品；D：CUR對照品；E：DOX/CUR-NPs；1：DOX，2：CUR）

圖2 DOX、CUR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 精密度試驗 低、中、高3個濃度的混合對照品溶液中，DOX的日內(nèi)精密度RSD分別為1.14%、1.05%、1.02%，日間精密度RSD分別為1.43%、1.20%、0.63%；CUR的日內(nèi)精密度RSD分別為1.36%、0.80%、0.55%，日間精密度RSD分別為1.64%、1.47%、0.64%，均符合方法學(xué)要求（RSD≤2%）。

2.4 回收率試驗 低、中、高3個濃度的混合對照品溶液中，DOX的回收率分別為96.7%、102.3%、98.0%，RSD分別為1.57%、1.10%、1.76%；CUR的回收率分別為104.3%、95.7%、102.5%，RSD分別為1.31%、1.47%、1.35%，均符合方法學(xué)要求。

2.5 重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗 重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果DOX與CUR含量的RSD分別為1.30%和1.14%，符合方法學(xué)要求。在24h內(nèi)，測得DOX的RSD為1.15%，CUR的RSD為1.03%，表明樣品穩(wěn)定性良好，均符合方法學(xué)要求。

2.6 超速離心回收率 超速離心法可實現(xiàn)納米粒與游離藥物的分離，低、中、高3個濃度的超速離心回收率見表1。

表1 游離藥物與納米粒的分離結(jié)果

2.7 藥物含量和包封率測定 DOX/CUR-NPs中DOX含量為45.5μg/ml，RSD為1.28%；CUR含量為233.2μg/ ml，RSD為 1.42%；DOX與 CUR的包封率分別為（58.9±1.11）%和（75.4±1.76）%，詳見表2。

表2 含量和包封率測定結(jié)果

3 討論

多藥耐藥是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因之一[1]。納米粒系一種新型藥物載體，有學(xué)者嘗試將DOX與CUR同時包裹于納米粒，發(fā)現(xiàn)可在較大程度上逆轉(zhuǎn)MDR，同時降低了其對正常細(xì)胞的毒性[4-5]，故研制DOX/CUR-NPs具有較大的意義。但DOX與CUR的水溶性相差較大。Jinghua等[4]分別采用HPLC法來測定納米粒中DOX與CUR的含量，而Ranjita等[5]則采用熒光分光光度計法和HPLC法分別測定兩藥含量，均操作繁瑣，耗時耗力。本文通過多次篩選，最終確定以乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鈉（磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）作為流動相，梯度洗脫，檢測波長在相應(yīng)時間調(diào)整為DOX最大吸收波長233nm及CUR最大吸收波長425 nm。在此色譜條件下，DOX與CUR分離良好，保留時間合適，輔料及溶劑不干擾測定，結(jié)果準(zhǔn)確，回收率高，重復(fù)性好，為DOX/CUR載雙藥系統(tǒng)中藥物含量測定提供了一種簡便、快速、有效的方法。

包封率的測定方法主要有超速離心法，透析法，超濾離心法和凝膠色譜法等[6-8]。后兩者大多用于脂質(zhì)體包封率的測定，而透析法透析過程緩慢，易造成藥物的泄露且比較費時；故本實驗采用低溫超速離心法分離藥物與納米粒。回收率實驗表明，該離心條件滿足實驗要求，達(dá)到了較好的分離效果。

本實驗僅采用了紫外分光檢測器，其測得藥物的線性范圍為0.5～50 μg/ml，難以達(dá)到藥物在體內(nèi)的分析要求。而DOX與CUR均具有熒光特性，故下一步可采用熒光分光檢測器，提高靈敏度，為DOX/CUR載雙藥納米粒的體內(nèi)藥動學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

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Simultaneous determination of content and entrapment efficiency of doxorubixin and curcumin loaded nanoparticles by HPLC

LIN Hongxia, DAI Dongbo,DING ding,et al.
Department of Clinical Laboratory,Wenlin First People's Hospital,Wenling 317500,China

【 Abstract】 Objective To establish a HPLC method for the simultaneous determination of content and entrapment efficiency of doxorubixin and curcumin loaded mPEG-PLA nanoparticles(DOX/CUR-NPs). Methods The DOX/CUR-NPs were prepared by emulsion-solvent evaporation method.The specificity,precision,recovery and other tests of the established HPLC method were investigated according to analysis methodology for pharmaceutical preparations.The entrapment efficiency was determined by HPLC combined with centrifugal ultrafiltration. Results The DOX/CUR-NPs were prepared successfully.Under the HPLC conditions established,specificity,precision,recovery,repeatability of DOC and CUR met the challenge of analysis methodology.A good linear relationship was found between the peak area and the concentration of DOX and CUR ranging from 0.5μg/ml to 50.0μg/ml(r=0.9999),respectively.The entrapment efficiency of DOX and CUR in nanoparticles was (58.9±1.11)%and (75.4±1.76)%,respectively. Conclusion The established method is simple,accurate,sensitive and suitable for simultaneous determination of content and entrapment efficiency of doxorubixin and curcumin loaded nanoparticles.

Doxorubixin Curcumin Dual-loaded nanoparticles Content determination HPLC

2014-12-29）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

317500 溫嶺市第一人民醫(yī)院檢驗科（林紅霞、丁玎），藥劑科（戴東波、王茜）

戴東波，E-mail：linhx38_5@yeah.net