劉新亞等

[摘要]目的通過研究大鼠局灶性腦缺血再灌注后水通道蛋白4（AQP4）、蛋白激酶C（PKC）表達(dá)水平的變化，來探討兩者與腦水腫之間的關(guān)系。方法通過線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈缺血（MCAO）再灌注模型，動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Norm）、假手術(shù)組（Sham）、缺血再灌注組（CIR）。參照Garcia JH法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分、用Elliot法檢測(cè)腦組織含水量、免疫組化法檢測(cè)AQP4及PKC的表達(dá)。結(jié)果CIR后6h即有神經(jīng)功能缺損，腦含水量在CIR12h明顯升高，1～3d時(shí)達(dá)到高峰；AQP4表達(dá)在早期水平降低，從12h逐漸升高，至CIR 24h明顯升高，3d達(dá)高峰；PKC在CIR后6h開始持續(xù)性升高，至第5d仍保持較高水平。結(jié)論早期的細(xì)胞源性腦水腫可能和PKC的升高有關(guān)，后期的血管源性腦水腫可能和AQP4的升高相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]水通道蛋白4；蛋白激酶C；腦水腫

中圖分類號(hào)：R743.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1009_816X（2014）06_0456_03

[Abstract] Objective By studying the changes of expression levels of aquaporin4 （AQP4） and protein kinase C （PKC） after focal cerebral ischemia_reperfusion in rats to investigate the relation among AQP4， PKC and brain edema. Methods The model of middle cerebral artery （MCA） of rats was duplicated by using the suture method. The rats were randomly divided into normal control group （Norm）， sham_operation group （Sham）， cerebral ischemia reperfusion group （CIR）. Scores of neurofunctional defect were graded according to Garcia JH method， Elliot method was used to measure water content in brain tissue， the expression of AQP4 and PKC in brain tissue was observed by immunohistochemistry. Results After cerebral ischemia_reperfusion （CIR）， Neurofunctional defect occurred after 6h. Water content in brain tissue increased after CIR 12h， which was up to highest point after 1_3days. The expression levels of AQP4 decreased in early， then the levels increased gradually since 12h later， obviously increased CIR24 h， and to highest point after 3 days. While PKC increased gradually after CIR6h， and kept high level for 5 days. Conclusions Early Cell_derived brain edema may relate to the rise of PKC； upper vasogenic brain edema may be related to the rise of AQP4.

[Key words] Aquaporin4 （AQP4）； Protein Kinase C （PKC）； Brain edema

水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）與腦水腫關(guān)系密切[1]，AQP4是分布在腦組織中主要與水通透有關(guān)的水通道蛋白，具有選擇性的水轉(zhuǎn)運(yùn)功能。目前對(duì)AQP4在水分子轉(zhuǎn)運(yùn)及水平衡調(diào)節(jié)過程中具體作用機(jī)制越來越被眾多學(xué)者關(guān)注：AQP4參與了腦缺血再灌注（cerebral ischemic reperfusion，CIR）后腦水腫的形成[2]。研究發(fā)現(xiàn)AQP4的作用機(jī)制與G蛋白有關(guān)，而蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是G蛋白信號(hào)通路的中心分子之一，PKC或PKC的激活劑可以抑制AQP4的表達(dá)[3]；但也有實(shí)驗(yàn)證明，在腦損傷后，PKC表達(dá)水平升高，促使興奮性氨基酸、自由基等的釋放，加重神經(jīng)元缺血性損害，直接參與并加重了腦水腫的形成[4]。為此，我們以大鼠大腦中動(dòng)脈缺血（MCAO）再灌注模型為研究對(duì)象，研究AQP4、PKC在不同時(shí)相上的動(dòng)態(tài)變化與腦水腫的關(guān)系，來闡明兩者在腦水腫中的作用和相互關(guān)系。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及分組：由南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，健康雄性SD大鼠72只，鼠齡3～4個(gè)月，體重在280～330g，等級(jí)：cl，術(shù)中、術(shù)后死亡或神經(jīng)功能評(píng)分未達(dá)要求者由備用組補(bǔ)充，具體分組見表1。

1.3方法：線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注（MCAO/R）模型，缺血2h后，恢復(fù)再灌注，假手術(shù)組行相同手術(shù)，但置入線栓深度小于10mm。參照Garcia JH[5]的方法對(duì)所有實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，最高評(píng)分為18分、最低為3分；采用Elliot公式計(jì)算腦組織含水量，腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%；采用SABC法行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果判定依據(jù)染色強(qiáng)度和陽性目標(biāo)的數(shù)量不同進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分分為0～7、共8個(gè)等級(jí)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)，用Tamhane's T2檢驗(yàn)。均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，雙變量關(guān)系采用直線相關(guān)分析，顯著性水準(zhǔn)均為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見表2：假手術(shù)組與正常對(duì)照組AQP4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平出現(xiàn)了降低，CIR 12h起水平逐漸升高，24h時(shí)明顯升高，與正常腦組織水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；至CIR 3d時(shí)達(dá)到峰值，至第5d雖有所下降，但仍維持在較高水平；神經(jīng)功能缺損評(píng)分自CIR 6h即明顯下降，腦含水量在CIR 12h改變明顯（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就已經(jīng)有明顯升高，持續(xù)至第5天仍保持較高水平。由此可以看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情況下，水腫就已經(jīng)明顯發(fā)生，提示此時(shí)參與腦水腫形成的可能主要是PKC。

3討論AQP4常表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，尤其是與毛細(xì)血管和軟腦膜接觸的膠質(zhì)細(xì)胞膜處，參與了腦缺血/出血、腦創(chuàng)傷及腦腫瘤等繼發(fā)的腦水腫的形成過程，但有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及機(jī)制的觀點(diǎn)一直存在爭(zhēng)議。近幾年的諸多實(shí)驗(yàn)的結(jié)果逐漸趨向認(rèn)為AQP4在缺血后腦水腫中表達(dá)增多可加重腦水腫，表達(dá)減少可減輕腦水腫[6]。關(guān)于AQP4表達(dá)的調(diào)節(jié)亦不很清楚，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素、鎂離子、黃體酮、鈣離子、氯醌、丙泊酚及煙酰胺等藥物可對(duì)其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7，8]，但最有說服力的是蛋白激酶C（PKC），可以通過磷酸化的方式調(diào)節(jié)AQP4的活性，Harada等[9]研究了鼠CIR后PKC活性的變化，發(fā)現(xiàn)缺血20min再灌注早期，海馬區(qū)放射活性明顯增高，再灌注6～12h放射活性達(dá)最高峰，7d后放射活性下降，而且活性升高的PKC存在膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，即細(xì)胞膜的PKC活性升高，而細(xì)胞漿的活性相對(duì)下降，推測(cè)是機(jī)體的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，為膜的易位激活，考慮到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此時(shí)的AQP4水平也出現(xiàn)了降低，更能顯現(xiàn)出PKC對(duì)AQP4活性的抑制，使我們可以推測(cè)出其膜轉(zhuǎn)移的意義在于自身調(diào)控AQP4的表達(dá)，減輕腦水腫，為機(jī)體保持最適宜的內(nèi)環(huán)境。但PKC激活后可促進(jìn)興奮性氨基酸釋放，加重神經(jīng)元缺血性損害，可引起細(xì)胞源性腦水腫。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，PKC在CIR損傷的病理生理機(jī)制中可能扮演的角色：在CIR早期機(jī)體通過自身調(diào)節(jié)PKC表達(dá)增加，通過磷酸化的方式使AQP4失活，減輕腦水腫，是一種保護(hù)性反應(yīng)，過早抑制PKC可能加重腦水腫，正如諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，早期使用鈣離子拮抗劑如尼莫地平，并不能減少AQP4表達(dá)，不能減輕腦水腫，因PKC是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白激酶，隨缺血再灌注時(shí)間的延長，各種損傷因子持續(xù)作用以及神經(jīng)元細(xì)胞壞死，超出機(jī)體代償范圍，PKC不能有效地減少AQP4表達(dá)，AQP4增多，致血腦屏障破壞，引起嚴(yán)重的血管源性腦水腫，也就是早期以細(xì)胞源性腦水腫為主，后期以血管源性水腫為主，同時(shí)伴隨細(xì)胞源性腦水腫。通過PKC激活劑可減少AQP4表達(dá)，但能否減輕腦水腫尚待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]汪匯，方帆，江華.AQP4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作用的研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012，（5）：531-534.

[2]Tait MJ， Saadoun S， Bell BA， et al. Increased brain edema in AQP4_null mice in an experimental model of subarachnoid hemorrhage[J]. Neuroscience，2010，167（1）：60-67.

[3]Zhu SM， Xiong XX， Zheng YY， et al. Propofol inhibits aquaporin 4 expression through a protein kinase C_dependent pathway in an astrocyte model of cerebral ischemia/reoxygenation[J]. Anesth Analg，2009，109（5）：1493-1499.

[4]Hoshi A， Yamamoto T， Shimizu K， et al. Chemical preconditioning_induced reactive astrocytosis contributes to the reduction of post_ischemic edema through aquaporin_4 downregulation[J]. Exp Neurol，2011，227（1）：89-95.

[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.

[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.

[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.

[8]陳應(yīng)柱，張嫻嫻，沈雪.丁基苯酞對(duì)放射性腦損傷模型大鼠皮質(zhì)AQP4表達(dá)影響的觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2013，（2）：93-96.

[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.

（收稿日期：2014_6_23）

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)，用Tamhane's T2檢驗(yàn)。均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，雙變量關(guān)系采用直線相關(guān)分析，顯著性水準(zhǔn)均為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見表2：假手術(shù)組與正常對(duì)照組AQP4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平出現(xiàn)了降低，CIR 12h起水平逐漸升高，24h時(shí)明顯升高，與正常腦組織水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；至CIR 3d時(shí)達(dá)到峰值，至第5d雖有所下降，但仍維持在較高水平；神經(jīng)功能缺損評(píng)分自CIR 6h即明顯下降，腦含水量在CIR 12h改變明顯（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就已經(jīng)有明顯升高，持續(xù)至第5天仍保持較高水平。由此可以看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情況下，水腫就已經(jīng)明顯發(fā)生，提示此時(shí)參與腦水腫形成的可能主要是PKC。

3討論AQP4常表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，尤其是與毛細(xì)血管和軟腦膜接觸的膠質(zhì)細(xì)胞膜處，參與了腦缺血/出血、腦創(chuàng)傷及腦腫瘤等繼發(fā)的腦水腫的形成過程，但有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及機(jī)制的觀點(diǎn)一直存在爭(zhēng)議。近幾年的諸多實(shí)驗(yàn)的結(jié)果逐漸趨向認(rèn)為AQP4在缺血后腦水腫中表達(dá)增多可加重腦水腫，表達(dá)減少可減輕腦水腫[6]。關(guān)于AQP4表達(dá)的調(diào)節(jié)亦不很清楚，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素、鎂離子、黃體酮、鈣離子、氯醌、丙泊酚及煙酰胺等藥物可對(duì)其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7，8]，但最有說服力的是蛋白激酶C（PKC），可以通過磷酸化的方式調(diào)節(jié)AQP4的活性，Harada等[9]研究了鼠CIR后PKC活性的變化，發(fā)現(xiàn)缺血20min再灌注早期，海馬區(qū)放射活性明顯增高，再灌注6～12h放射活性達(dá)最高峰，7d后放射活性下降，而且活性升高的PKC存在膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，即細(xì)胞膜的PKC活性升高，而細(xì)胞漿的活性相對(duì)下降，推測(cè)是機(jī)體的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，為膜的易位激活，考慮到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此時(shí)的AQP4水平也出現(xiàn)了降低，更能顯現(xiàn)出PKC對(duì)AQP4活性的抑制，使我們可以推測(cè)出其膜轉(zhuǎn)移的意義在于自身調(diào)控AQP4的表達(dá)，減輕腦水腫，為機(jī)體保持最適宜的內(nèi)環(huán)境。但PKC激活后可促進(jìn)興奮性氨基酸釋放，加重神經(jīng)元缺血性損害，可引起細(xì)胞源性腦水腫。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，PKC在CIR損傷的病理生理機(jī)制中可能扮演的角色：在CIR早期機(jī)體通過自身調(diào)節(jié)PKC表達(dá)增加，通過磷酸化的方式使AQP4失活，減輕腦水腫，是一種保護(hù)性反應(yīng)，過早抑制PKC可能加重腦水腫，正如諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，早期使用鈣離子拮抗劑如尼莫地平，并不能減少AQP4表達(dá)，不能減輕腦水腫，因PKC是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白激酶，隨缺血再灌注時(shí)間的延長，各種損傷因子持續(xù)作用以及神經(jīng)元細(xì)胞壞死，超出機(jī)體代償范圍，PKC不能有效地減少AQP4表達(dá)，AQP4增多，致血腦屏障破壞，引起嚴(yán)重的血管源性腦水腫，也就是早期以細(xì)胞源性腦水腫為主，后期以血管源性水腫為主，同時(shí)伴隨細(xì)胞源性腦水腫。通過PKC激活劑可減少AQP4表達(dá)，但能否減輕腦水腫尚待進(jìn)一步研究。

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[4]Hoshi A， Yamamoto T， Shimizu K， et al. Chemical preconditioning_induced reactive astrocytosis contributes to the reduction of post_ischemic edema through aquaporin_4 downregulation[J]. Exp Neurol，2011，227（1）：89-95.

[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.

[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.

[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.

[8]陳應(yīng)柱，張嫻嫻，沈雪.丁基苯酞對(duì)放射性腦損傷模型大鼠皮質(zhì)AQP4表達(dá)影響的觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2013，（2）：93-96.

[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.

（收稿日期：2014_6_23）

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)，用Tamhane's T2檢驗(yàn)。均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，雙變量關(guān)系采用直線相關(guān)分析，顯著性水準(zhǔn)均為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見表2：假手術(shù)組與正常對(duì)照組AQP4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平出現(xiàn)了降低，CIR 12h起水平逐漸升高，24h時(shí)明顯升高，與正常腦組織水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；至CIR 3d時(shí)達(dá)到峰值，至第5d雖有所下降，但仍維持在較高水平；神經(jīng)功能缺損評(píng)分自CIR 6h即明顯下降，腦含水量在CIR 12h改變明顯（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就已經(jīng)有明顯升高，持續(xù)至第5天仍保持較高水平。由此可以看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情況下，水腫就已經(jīng)明顯發(fā)生，提示此時(shí)參與腦水腫形成的可能主要是PKC。

3討論AQP4常表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，尤其是與毛細(xì)血管和軟腦膜接觸的膠質(zhì)細(xì)胞膜處，參與了腦缺血/出血、腦創(chuàng)傷及腦腫瘤等繼發(fā)的腦水腫的形成過程，但有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及機(jī)制的觀點(diǎn)一直存在爭(zhēng)議。近幾年的諸多實(shí)驗(yàn)的結(jié)果逐漸趨向認(rèn)為AQP4在缺血后腦水腫中表達(dá)增多可加重腦水腫，表達(dá)減少可減輕腦水腫[6]。關(guān)于AQP4表達(dá)的調(diào)節(jié)亦不很清楚，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素、鎂離子、黃體酮、鈣離子、氯醌、丙泊酚及煙酰胺等藥物可對(duì)其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7，8]，但最有說服力的是蛋白激酶C（PKC），可以通過磷酸化的方式調(diào)節(jié)AQP4的活性，Harada等[9]研究了鼠CIR后PKC活性的變化，發(fā)現(xiàn)缺血20min再灌注早期，海馬區(qū)放射活性明顯增高，再灌注6～12h放射活性達(dá)最高峰，7d后放射活性下降，而且活性升高的PKC存在膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，即細(xì)胞膜的PKC活性升高，而細(xì)胞漿的活性相對(duì)下降，推測(cè)是機(jī)體的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，為膜的易位激活，考慮到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此時(shí)的AQP4水平也出現(xiàn)了降低，更能顯現(xiàn)出PKC對(duì)AQP4活性的抑制，使我們可以推測(cè)出其膜轉(zhuǎn)移的意義在于自身調(diào)控AQP4的表達(dá)，減輕腦水腫，為機(jī)體保持最適宜的內(nèi)環(huán)境。但PKC激活后可促進(jìn)興奮性氨基酸釋放，加重神經(jīng)元缺血性損害，可引起細(xì)胞源性腦水腫。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，PKC在CIR損傷的病理生理機(jī)制中可能扮演的角色：在CIR早期機(jī)體通過自身調(diào)節(jié)PKC表達(dá)增加，通過磷酸化的方式使AQP4失活，減輕腦水腫，是一種保護(hù)性反應(yīng)，過早抑制PKC可能加重腦水腫，正如諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，早期使用鈣離子拮抗劑如尼莫地平，并不能減少AQP4表達(dá)，不能減輕腦水腫，因PKC是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白激酶，隨缺血再灌注時(shí)間的延長，各種損傷因子持續(xù)作用以及神經(jīng)元細(xì)胞壞死，超出機(jī)體代償范圍，PKC不能有效地減少AQP4表達(dá)，AQP4增多，致血腦屏障破壞，引起嚴(yán)重的血管源性腦水腫，也就是早期以細(xì)胞源性腦水腫為主，后期以血管源性水腫為主，同時(shí)伴隨細(xì)胞源性腦水腫。通過PKC激活劑可減少AQP4表達(dá)，但能否減輕腦水腫尚待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014_6_23）