農(nóng)霖

廣西南寧美麗有約農(nóng)霖美容外科機(jī)構(gòu)，廣西 南寧 530011

脂肪干細(xì)胞（ADSCs）是存在于脂肪組織基質(zhì)中，且增殖能力較強(qiáng)，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）相似，具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞[1]。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，生物材料和組織工程技術(shù)得到了很大的發(fā)展[2]，干細(xì)胞應(yīng)用于骨組織的修復(fù)已經(jīng)成為了治療骨缺損的新思路。而選擇擴(kuò)增簡(jiǎn)單、來(lái)源豐富的種子細(xì)胞已成為骨組織工程研究的重要課題。ADSCs取材較為容易，其在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中比較容易定向分化為骨細(xì)胞,ADSCs不僅克服了BMSCs取材困難，機(jī)體損傷大的缺點(diǎn)，還具有來(lái)源充足、具有良好的體外擴(kuò)增能力的特點(diǎn)，有望成為骨組織工程中最大的種子細(xì)胞庫(kù)[3]。

1 . 脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特性

1.1 脂肪干細(xì)胞的基因與蛋白表達(dá)

醫(yī)學(xué)界已經(jīng)證實(shí)，脂肪干細(xì)胞能夠表達(dá)胚胎干細(xì)胞以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所表達(dá)的多種相關(guān)基因，例如：UTF-1、Oct4、Nodal等。此外，脂肪干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞二者間關(guān)于有絲分裂、血管生成、分化信號(hào)傳導(dǎo)通路組成以及基質(zhì)重塑的基因是共享的，包括金屬蛋白酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及血小板源性生長(zhǎng)因子等[4]。此外，有研究表明[5]，與脂肪干細(xì)胞高度轉(zhuǎn)錄有關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)炎癥、重塑、組織修復(fù)的基因包括纖維連接蛋白、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3以及骨結(jié)合素等。但是，脂肪干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)使得其基因的表達(dá)出現(xiàn)了很多復(fù)雜性的變化，由于培養(yǎng)擴(kuò)增導(dǎo)致了以下基因的表達(dá)水平提高：ACVR1、ACTG2、CCNE1、CDH1、PUM2等。由于培養(yǎng)擴(kuò)增，以下基因的表達(dá)水平減低：CDKN1B、INS、WNT6等。

1.2 脂肪干細(xì)胞的鑒定

目前，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行了深入的研究，希望找出鑒定脂肪干細(xì)胞的有效方法，但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)鑒定脂肪干細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。但有相關(guān)學(xué)者通過(guò)流式細(xì)胞儀以及免疫組化法對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行研究[6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞與周細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞共同擁有許多表面的標(biāo)記物。脂肪干細(xì)胞與周細(xì)胞相同的標(biāo)記物為α平滑肌肌動(dòng)蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)蛋白多糖2等。而與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的共同標(biāo)記為CD12、CD29、CD44、CD58等。此外，脂肪干細(xì)胞在體外增殖許多代后，后代細(xì)胞仍具有十分完好的細(xì)胞標(biāo)志物，且分化能力也十分強(qiáng)，因此其成為種子細(xì)胞庫(kù)具有十分大的優(yōu)勢(shì)。

1.3 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)與擴(kuò)增

人體脂肪組織內(nèi)干細(xì)胞的含量極低，若對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行利用，必須進(jìn)行體外分離及培養(yǎng)。目前應(yīng)用最為廣泛的增殖方法是使用膠原消化酶，將已經(jīng)剪碎的脂肪組織消化，然后進(jìn)行離心操作，將沉淀物用含有胎牛血清的培養(yǎng)液接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并將培養(yǎng)瓶放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，去除培養(yǎng)瓶，使用培養(yǎng)基把未貼壁的細(xì)胞漂洗清除，自此之后每三天更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)原代細(xì)胞培養(yǎng)8d左右，且生長(zhǎng)融合達(dá)到了80%時(shí)，使用胰酶對(duì)組織進(jìn)行常規(guī)消化，按照1:3的比例傳代接種到新的培養(yǎng)皿中進(jìn)行持續(xù)的體外擴(kuò)增培養(yǎng)。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行觀察記錄發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在剛貼壁時(shí)，其形態(tài)大多呈圓形、短棱形以及多角形，且大小各不相同。經(jīng)過(guò)三至四代的培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)棱形，且排列較為緊密，呈現(xiàn)出一種旋渦狀，胞質(zhì)與核仁十分的豐富。此外，在對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的時(shí)候，對(duì)于血清的選擇沒(méi)有特殊的要求，不需要添加物脂肪干細(xì)胞便能較為良好的生長(zhǎng)，且進(jìn)行低溫凍存對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)以及表型無(wú)明顯影響。有研究表明，在體外進(jìn)行培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞，其生物學(xué)特性能夠在培養(yǎng)13～15代后，仍然能夠保持不變，且衰老以及死亡的細(xì)胞只占很小的比例[7]，說(shuō)明了脂肪干細(xì)胞在體外具有較強(qiáng)的擴(kuò)增以及自我更新能力。

1.4 脂肪干細(xì)胞的分化潛能

隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)于脂肪干細(xì)胞研究的不斷深入，已有大量的報(bào)道表明脂肪干細(xì)胞在體外和體內(nèi)均具有分化成多種細(xì)胞系的潛能[8]。脂肪干細(xì)胞最早于2001年首次從人的脂肪組織中分離出來(lái)并實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)，并且成功地實(shí)現(xiàn)了在體外環(huán)境下向脂肪樣細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞等多種細(xì)胞的定向分化，證實(shí)了脂肪干細(xì)胞具有多向分化的潛能。此外，影響脂肪干細(xì)胞分化的潛能的因素有供體的性別、年齡以及脂肪干細(xì)胞的獲取部位。相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示，從GFP轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠中獲得的脂肪干細(xì)胞要顯著多于雄性小鼠。這一現(xiàn)象在人類身上正好相反，從男性體內(nèi)獲得的脂肪干細(xì)胞的成骨分化潛能要顯著高于女性供體獲得的脂肪干細(xì)胞。此外，同樣的研究還發(fā)現(xiàn)[9]，男性供體各個(gè)不同的部位所獲取的脂肪干細(xì)胞分化潛能也各不相同，經(jīng)腹部抽脂的表層脂肪內(nèi)獲取的脂肪干細(xì)胞比深層脂肪內(nèi)獲取的脂肪干細(xì)胞的分化速度更快。而這一發(fā)現(xiàn)在女性供體上表現(xiàn)的并不明顯。同時(shí)有研究表明[10]，供體的年齡與脂肪干細(xì)胞脂肪的形成潛能無(wú)明顯影響，但對(duì)于成骨潛能卻影響較大，二者呈明顯的反比例關(guān)系，造成這種現(xiàn)象的原因可能與衰老的過(guò)程中，不同性別的激素水平變化有關(guān)。這些研究為脂肪干細(xì)胞的實(shí)際應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

2 . 脂肪干細(xì)胞的應(yīng)用

2.1 脂肪干細(xì)胞在骨組織內(nèi)的應(yīng)用

在對(duì)于誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向成骨方向的分化研究中,較為常用的體外成骨誘導(dǎo)劑有抗壞血酸、地塞米松等。ADSCs在受到誘導(dǎo)時(shí)，其表面會(huì)形成類似于成骨細(xì)胞的突起形態(tài)，經(jīng)茜素紅染色可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)鈣小結(jié)，并表達(dá)出Ⅰ型膠原以及磷酸酶。若在體外培養(yǎng)皿內(nèi)加入成骨蛋白-1，可以更加顯著促進(jìn)細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)以及骨橋蛋白的形成。Qiang報(bào)道表明[11]，脂肪干細(xì)胞經(jīng)成骨培養(yǎng)后，能夠表達(dá)出多種成骨細(xì)胞的相關(guān)基因，如Ⅰ型膠原、磷酸酶、骨連接素等。此外，影響脂肪干細(xì)胞的成骨因素有多種，具體如下：（1）供體因素。王偉等人經(jīng)研究表明[12]，供體的部位、性別均直接影響到脂肪干細(xì)胞的成骨效果，來(lái)自于內(nèi)臟脂肪組織的脂肪干細(xì)胞的成骨能力顯著優(yōu)于皮下脂肪干細(xì)胞；男性供體脂肪干細(xì)胞成骨能力顯著優(yōu)于女性；但年齡對(duì)于脂肪干細(xì)胞的成骨能力的影響目前醫(yī)學(xué)界存在一定的爭(zhēng)議，但可以肯定的是連續(xù)多代增殖的脂肪干細(xì)胞成脂能力顯著下降，但成骨能力卻明顯增強(qiáng)。（2）分化誘導(dǎo)因子對(duì)于脂肪干細(xì)胞的成骨能力存在著較大的影響。有研究表明，骨形成蛋白2、4可以顯著增強(qiáng)脂肪干細(xì)胞的成骨能力。此外，Nicholas等人的報(bào)道表明[13]，富血小板血漿同樣具有促進(jìn)脂肪干細(xì)胞體外增殖以及成骨能力的作用，而褪黑激素則具有抑制脂肪干細(xì)胞的增長(zhǎng)以及成骨分化能力的作用。（3）其他因素。拉伸應(yīng)變、氧濃度、雌激素以及鈣離子濃度等相關(guān)因素也能夠?qū)χ靖杉?xì)胞的成骨能力造成影響。

2.2 脂肪干細(xì)胞應(yīng)用與皮膚創(chuàng)面愈合

Jiang yang報(bào)道[14]，脂肪干細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞間接觸與旁分泌激活來(lái)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，在體外及動(dòng)物活體創(chuàng)傷模型中，粵閱雜悅澤均表現(xiàn)出加速傷口愈合的特性。Nicholas et al[13]在免疫缺陷小鼠上制造創(chuàng)傷模型，然后分別用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和ADM聯(lián)合ADSCs處理傷口，發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞組的愈合率明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明脂肪干細(xì)胞具有急速傷口愈合的能力

2.3 脂肪干細(xì)胞在皮膚整形領(lǐng)域的應(yīng)用

整形和重建外科中經(jīng)常應(yīng)用到皮瓣移植，手術(shù)不成功會(huì)遇到皮瓣部分壞死甚至全部壞死，脂肪干細(xì)胞的運(yùn)用能提高皮瓣的成活率。Yu Fet al報(bào)道[15]，脂肪干細(xì)胞可以為皮瓣增加血供，進(jìn)而提高了成活率，Jia HY et al報(bào)道[16]，脂肪干細(xì)胞可以通過(guò)旁分泌減輕自由基對(duì)皮膚的的傷害，從而導(dǎo)致皺紋的減輕。

3 . 存在的問(wèn)題

（1）由于脂肪干細(xì)胞缺乏特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志物，因此分離并純化存在較大困難。（2）脂肪干細(xì)胞的體外定向誘導(dǎo)分化機(jī)制尚不明確，如何準(zhǔn)確的將脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化是目前首要解決的問(wèn)題之一。（3）脂肪干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的安全性有待進(jìn)一步評(píng)估。（4）尋找到合適的支架材料是骨組織工程成功的關(guān)鍵。

4 小 結(jié)

脂肪干細(xì)胞由于取材方便、來(lái)源豐富、患者痛苦小、無(wú)倫理糾紛等優(yōu)點(diǎn)，因此，對(duì)其增殖和分化潛能進(jìn)行深入研究，必將促進(jìn)外科整形與組織工程領(lǐng)域的發(fā)展。但是，培養(yǎng)早期的干細(xì)胞具有多向分化的潛能，而培養(yǎng)至晚期則出現(xiàn)老化特征，另外，干細(xì)胞誘導(dǎo)液含有的生長(zhǎng)因子與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，且價(jià)格較高，因此，如何高效、廉價(jià)、無(wú)副作用的誘導(dǎo)干細(xì)胞分化是急需解決的科技難題?？傊?，隨著和細(xì)胞生物學(xué)的不斷進(jìn)步，脂肪干細(xì)胞的研究必將不斷深入，其獨(dú)特的優(yōu)越性，必將在整形美容等域及組織工程的構(gòu)建與骨缺損修復(fù)等外科領(lǐng)域，成為一種有效的軟組織填充物。

[1] Xuefeng, Qiu Jacqueline, Villalta Ludovic,et al.Effects of intravenous injection of adiposederived stem cells in a rat model of radiation therapy-induced erectile dysfunction[J].The journal of sexual medicine,2012,9（7）：1834-1841.

[2] 黃偉鋒，姜平.脂肪干細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2015,32（1）:208-209.

[3] Yazmín,Macotela Brice, Emanuelli Marcelo A,et al.Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots[J].The American Diabetes Associationresource guide,2012,61（7）：1691-1699.

[4] 景元海，胡艷波，常樹(shù)松等.BMSCs移植后脊髓損傷大鼠VEGF表達(dá)的變化[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(6):814-816.

[5] 石園園，楊向群.脂肪源性干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究進(jìn)展[J].組織工程與重建外科雜志,2014,1（6）：351-354.

[6] Jun,Liu Xiaodong,Wang Qiming,et al.The stimulation of adipose-derived stem cell differentiation and mineralization by ordered rod-like fluorapatite coatings[J].Biomaterials,2012,33（20）:5036-5046.

[7] 古振，劉芳.脂肪干細(xì)胞在骨組織工程中的研究進(jìn)展[J].組織工程與重建外科，2012，8(1)：53-55.

[8] 李佳成,郭燕珊,屠美等.胚胎干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)人脂肪干細(xì)胞增殖及分化能力的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）,2014,35（2）:169-176.

[9] Adipose tissue-derived multipotent stromal cells have a higher immunomodulatory capacity than their bone marrow-derived counterparts[J].Stem cells translational medicine，2013,2（6）：455-463.

[10] 楊杰,郭能強(qiáng),孫家明等.體外誘導(dǎo)乳房?jī)?nèi)脂肪來(lái)源干細(xì)胞向上皮細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華整形外科雜志,2014,30（3）:209-214.

[11] Qiang, Yang Yan-hong,Zhao Qun,et al.Novel cartilage-derived biomimetic scaffold for human nucleus pulposus regeneration:a promising therapeutic strategy for symptomatic degenerative disc diseases[J].Orthopaedic surgery,2013,5（1）:60-63.

[12] 王偉,阿里木江?阿不來(lái)提,艾爾肯?熱合木吐拉,等.三維打印技術(shù)構(gòu)建仿生人類指骨支架血管化的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2014,31（7）:1431-1433.

[13] Nicholas,Bryan Fiona C,Lewis Damian,et al.Evaluation of a novel non-destructive catch and release technology for harvesting autologous adult stem cells[J].PloS one,2013,8（1）：539-541.

[14] Jiangyang,Sun Yufeng,Yuan Haiquan,et al.Serum from hepatectomized rats induces the differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells into hepatocytelike cells and upregulates the expression of hepatocyte growth factor and interleukin-6 in vitro[J].International journal of molecular medicine,2013,31（3）:667-675.

[15] Yu F,Ji S, Su L,et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells inhibit activation of hepatic stellate cells in vitro and ameliorate rat liver fibrosis in vivo[J].J Formos Med Assoc,2015,114(2):130-138.

[16] Jia HY,Yu JH,Lei TC,et al.The multi-lineage differentiation and angiogenesis ability of adipose-derived adult mesenchymal stem cells[J].Clin Lab,2014,60(10):1747-1755.