陳珊珊， 孫 芳， 羅 培， 周 婕

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001)

新型β-環(huán)糊精手性固定相的合成及其對(duì)貝凡洛爾的拆分

陳珊珊， 孫 芳， 羅 培， 周 婕

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001)

采用分步法合成一種新型β-環(huán)糊精衍生物并化學(xué)鍵合到γ-巰丙基硅膠上.在合成中的每步均對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化及表征，并確證化合物的結(jié)構(gòu)，采用濕法裝柱將自制的手性固定相裝填成色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm).在高效液相色譜中，流動(dòng)相為甲醇-25 mmol/L KH2PO4(60/40，V/V)，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為259 nm，色譜柱溫為25 ℃時(shí)，此新型β-環(huán)糊精衍生物鍵合硅膠手性固定相對(duì)貝凡洛爾表現(xiàn)出良好的分離特性.

β-環(huán)糊精衍生物； CSP； HPLC； 貝凡洛爾； 手性拆分

0 引言

β-環(huán)糊精及其衍生物作為固定相在手性拆分色譜中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[1-2].雖然天然環(huán)糊精化合物能拆分部分對(duì)映體[3]，但它仍存在一些不足之處：如包合選擇性不強(qiáng)，水溶性低，缺乏光譜特性等，因此天然環(huán)糊精在手性拆分中的應(yīng)用受到了限制，而環(huán)糊精的衍生物往往能夠克服這些缺點(diǎn)[4].文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道了一種基于Staudinger反應(yīng)，以環(huán)糊精衍生物為基礎(chǔ)的手性固定相的簡(jiǎn)易合成方法，以此方法合成的手性固定相對(duì)多種外消旋體表現(xiàn)出良好的手性拆分能力.在分析物與衍生化的環(huán)糊精固定相之間可以引入額外的作用力，如偶極-偶極作用、離子對(duì)作用、靜電和空間立體作用等，使得環(huán)糊精衍生物的色譜特性、手性識(shí)別能力以及水溶性和包合能力都能得到提高.因此能通過(guò)環(huán)糊精類(lèi)化合物分離的對(duì)映體范圍大大擴(kuò)大[8-9].目前，許多官能團(tuán)如二硝基苯基[10]、苯羰基[11]和羧甲基[12]已被用于修飾環(huán)糊精.本文首次合成一種新型的手性固定相，并以貝凡洛爾為拆分對(duì)象考察此手性固定相的拆分特性.貝凡洛爾的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津HP1100高效液相色譜系統(tǒng)；BP211D1/10萬(wàn)天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ3200DE數(shù)控超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Vario EL/micro cube型號(hào)元素分析儀(德國(guó)Elementar公司)；0.25 μm微孔濾膜(上海新亞化工有限公司).

β-環(huán)糊精(山東濱州智源生物科技有限公司)；丙烯胺(山東鄒平銘興化工有限公司)；γ-巰丙基三乙氧基硅烷(KH-580，杭州硅寶化工有限公司)；3-氯-4-甲基-異氰酸苯酯(濮陽(yáng)宏大圣導(dǎo)新材料有限公司)；硅膠(10 nm，5 μm，中國(guó)青島美高化工有限公司)；貝凡洛爾(99.99%)由河南省食品藥品檢驗(yàn)所提供；實(shí)驗(yàn)中所用溶劑均為分析純；用于HPLC的溶劑均為色譜純.

1.2 新型β-環(huán)糊精衍生物手性固定相的合成

全(3-氯-4-甲基-苯基氨基甲酸酯基)-β-環(huán)糊精鍵合硅膠固定相的合成路線(xiàn)見(jiàn)圖2.

1.2.1 6-單-對(duì)甲基苯磺?；?β-環(huán)糊精(化合物1)的合成 稱(chēng)取30 g預(yù)處理的β-環(huán)糊精于500 mL單頸瓶中，加入250 mL超純水，機(jī)械攪拌30 min.在攪拌下，緩慢加入10 mL NaOH溶液，繼續(xù)反應(yīng)1 h；之后緩慢加入15 mL對(duì)甲基苯磺酰氯的乙腈溶液，再次反應(yīng)1 h，抽濾，得濾液.用鹽酸調(diào)濾液pH至8～9，可見(jiàn)大量白色絮狀沉淀出現(xiàn)，于4 ℃放置過(guò)夜后，抽濾，濾餅即為化合物1.

1.2.2 6-單-丙烯胺化-β-環(huán)糊精的合成(化合物2)的合成 稱(chēng)取2.30 g純化的化合物1于100 mL單頸瓶中，加入30 mL丙烯胺，于50 ℃機(jī)械攪拌回流5 h.在冰浴條件下，加入30 mL無(wú)水甲醇.攪拌5 min后，室溫下加入200 mL乙腈，此時(shí)出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，抽濾，得濾餅，即為化合物2.

1.2.3 全(3-氯-4-甲基-苯基氨基甲酸酯基)β-環(huán)糊精(化合物3)的合成 稱(chēng)取1.60 g 化合物2，加入30 mL無(wú)水吡啶和14 mL 3-氯-4-甲基-苯異氰酸酯，于85 ℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流24 h.抽濾得到淡黃色膠體，溶于200 mL無(wú)水乙酸乙酯，加入60 mL去離子水后，于室溫下攪拌2 h.分離出有機(jī)層，再經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，真空干燥，得到化合物3.

1.2.4 巰丙基硅膠(化合物4)的合成 稱(chēng)取預(yù)處理過(guò)的硅膠4.00 g于100 mL三頸瓶中，加入40 mL無(wú)水甲苯和150 μL三乙胺，N2保護(hù)，加熱回流，至110 ℃后迅速加入5 mL γ-巰丙基三乙氧基硅烷，110 ℃回流24 h.過(guò)濾，分別用甲苯、乙醚洗滌，真空干燥，即得巰丙基硅膠(化合物4).

1.2.5 β-環(huán)糊精衍生物鍵合固定相(化合物5)的合成 取4.00 g化合物4于100 mL單頸瓶中，加入40 mL無(wú)水甲苯，再加入4.00 g化合物3，0.20 g三苯基膦，N2保護(hù)，85～95 ℃機(jī)械攪拌加熱回流24 h.抽濾，依次用超純水、甲醇洗滌數(shù)次，真空干燥，即得β-環(huán)糊精衍生物鍵合固定相(化合物5).

1.2.6 β-環(huán)糊精衍生物手性色譜柱的裝填 采用勻漿法裝柱，甲醇作頂替液，在壓力8 000 psi下將自制手性固定相裝入不銹鋼柱(250 mm×4.6 mm I.D.).氯仿-二噁烷(1/1,V/V)作勻漿液，填充好的色譜柱用流動(dòng)相平衡12 h，以使分析結(jié)果能夠獲得好的重現(xiàn)性.

1.2.7 樣品和流動(dòng)相溶液的配制 樣品溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取貝凡洛爾5.0 mg，用流動(dòng)相配制成5 mL溶液，待用.流動(dòng)相的配制：甲醇-KH2PO4緩沖液 (60/40，V/V).

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 6-單-對(duì)甲基苯磺酰化-β-環(huán)糊精的表征 用干燥的KBr壓片，在波數(shù)為400～4 000 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定6-單-對(duì)甲基苯磺?；?β-環(huán)糊精的紅外光譜.6-單-對(duì)甲基苯磺?；?β-環(huán)糊精I(xiàn)R (cm-1,KBr):3 396(O—H,s)；2 927(sp3C—H,s)；1 034(C—O—C,s)；1 637、1 366 cm-1處的峰為苯環(huán)的特征吸收峰，833 cm-1為苯環(huán)對(duì)位取代的特征吸收峰，與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)基本一致.如圖3所示.

采用薄層色譜分析法，以丁酮-水-甲醇(8/2/1，V/V/V)為展開(kāi)劑，6-單-對(duì)甲基苯磺?；?β-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精的相對(duì)比移值為1.49，文獻(xiàn)[13]報(bào)道值為1.52.

對(duì)6-單-對(duì)甲基苯磺?；?β-環(huán)糊精進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為160～165 ℃，與文獻(xiàn)[3]報(bào)道值159～164 ℃基本一致.

圖3 6-單-對(duì)甲基苯磺?；?β-環(huán)糊精的紅外圖譜

Fig.3 The FT-IR spectra of mono-6-tosyl-β-cyclodextrin

圖4 6-單-丙烯胺化-β-環(huán)糊精紅外色譜圖

Fig.4 The FT-IR spectra of mono-6-allylamino-β-cyclodextrin

采用薄層色譜分析法，以丁酮-水-甲醇(8/4/1，V/V/V)為展開(kāi)劑，6-單-丙烯胺化-β-環(huán)糊精和6-單-對(duì)甲基苯磺酰化-β-環(huán)糊精的相對(duì)比移值為0.53，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道值0.54基本一致.

對(duì)6-單-丙烯胺化-β-環(huán)糊精進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為196～199 ℃，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道值197～200 ℃基本一致.

采用薄層色譜分析法，以乙酸乙酯-正己烷(1/2，V/V)為展開(kāi)劑，只有一個(gè)斑點(diǎn)出現(xiàn).

對(duì)全(3-氯-4-甲基-苯基氨基甲酸酯基)β-環(huán)糊精進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果為208～212 ℃，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道值202～208 ℃相似.

2.1.4 巰丙基硅膠的表征 用干燥的KBr壓片，在波數(shù)為400～4 000 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定巰丙基硅膠的紅外光譜.巰丙基硅膠IR(cm-1,KBr):3 451 cm-1左右的峰為巰基的伸縮振動(dòng)峰；2 917 cm-1、2 847 cm-1為—CH2、—CH的伸縮振動(dòng)峰；1 109 cm-1為Si—O—Si的伸縮振動(dòng)峰；810 cm-1為Si—O—Si 的彎曲振動(dòng)峰.IR光譜分析結(jié)果與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)基本一致，說(shuō)明本步反應(yīng)成功.如圖6所示.

圖5 全(3-氯-4-甲基-苯異氰酸酯基)β-環(huán)糊精的紅外色譜圖

Fig.5 The FT-IR of per(3-chlorine-4-methyl-phenylcarbamoylated)β-cyclodextrin

圖6 巰丙基硅膠的紅外色譜圖

Fig.6 The FT-IR of γ-mercaptopropyl-functionalized silica gel

全(3-氯-4-甲基-苯基氨基甲酸酯基)β-環(huán)糊精鍵合硅膠固定相的元素分析，分析實(shí)測(cè)結(jié)果為：C:11.83%,H:1.11%,N: 1.26%，其中N元素含量增加的結(jié)果表明全(3-氯-4-甲基-苯基氨基甲酸酯基)β-環(huán)糊精鍵合硅膠固定相的鍵合反應(yīng)成功.

由下面的公式，可算出全(3-氯-4-甲基-苯基氨基甲酸酯基)β-環(huán)糊精鍵合硅膠手性固定相中全(3-氯-4-甲基-苯基氨基甲酸酯基)β-環(huán)糊精的鍵合量約為1.52×10-7mol/m2.

2.2 HPLC中自制手性色譜柱對(duì)貝凡洛爾對(duì)映體的拆分

通過(guò)優(yōu)化色譜條件，貝凡洛爾在自制的手性色譜柱上得到了成功的拆分.最佳的色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇-25 mmol/L KH2PO4(60/40，V/V)，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為259 nm，色譜柱溫為25 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL.圖8為貝凡洛爾在最佳色譜條件下的拆分色譜圖.

由圖8可知，10 min之內(nèi)即實(shí)現(xiàn)了對(duì)貝凡洛爾對(duì)映體的拆分，并且達(dá)到了基線(xiàn)分離(Rs=2.35)，這對(duì)快速分析貝凡洛爾的兩種對(duì)映體的含量和實(shí)現(xiàn)制備分離提供了條件.

分析貝凡洛爾的分子結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，它可以通過(guò)多個(gè)位點(diǎn)與手性固定相相互作用，但是在反相的條件下，環(huán)糊精比較容易與相對(duì)疏水的異構(gòu)體形成包合物.由此可推斷，可能是貝凡洛爾的苯環(huán)進(jìn)入了環(huán)糊精的疏水空腔形成包合物，而親水的羥基以及仲氨基則可能是與手性固定相的氨基甲酸酯基之間形成氫鍵，最終達(dá)到了手性識(shí)別的結(jié)果.

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(責(zé)任編輯：王浩毅)

Synthesis of Novel β-cyclodextrin Derivatives and its Application in Separating of Bevantolol Enantiomers

CHEN Shanshan, SUN Fang, LUO Pei, ZHOU Jie

(SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

A novel β-cyclodextrin derivative was synthesized and chemically immobilized onto the surface of γ-mercaptopropyl-functionalized silica gel step by step. The products in each step were purified and characterized, and the structure had been confirmed. This chiral stationary phase (CSP) bonded on silica gel was packed into a column (250 mm×4.6 mm×5 μm) using a slurry-packing procedure. When mobile phase was methanol -25 mmol/L KH2PO4(60/40,V/V), the flow rate was 0.5 mL/min, the column temperature was 25 ℃ and the detection wavelength was 259 nm,bevantolol enantiomers were completely separated.

β-cyclodextrin derivative; csp; HPLC; bevantolol; chiral separation

2015-03-06

陳珊珊(1992—)，女，河南濮陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事手性拆分研究，E-mail:shan785006984@163.com;通訊作者：周婕(1978—)，女，河南鄭州人，副教授，博士，主要從事手性拆分研究，E-mail: jie_0822@163.com.

陳珊珊，孫芳，羅培，等.新型β-環(huán)糊精手性固定相的合成及其對(duì)貝凡洛爾的拆分[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2015，47(4:)：66-70.

R917

A

1671-6841(2015)04-0066-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.013