■瞿紅俠 王建國(guó)， 陳冠華， 張金龍， 韓進(jìn)誠(chéng) 閆永峰 王志祥 鄭永祥

（1.商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，河南商丘 476000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；3.宜蘭大學(xué)生物技術(shù)與動(dòng)物科學(xué)系，臺(tái)灣宜蘭 26047）

1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2-D3]是動(dòng)物和人體內(nèi)維生素D3發(fā)揮其生物學(xué)作用的最終活性形式。1α-羥基維生素D3（1α-OH-D3）是維生素D3的衍生物。1α-OH-D3不需腎臟轉(zhuǎn)化，它直接在肝臟經(jīng)25-羥化酶羥化快速轉(zhuǎn)化為1,25-(OH)2-D3[1]。研究顯示，以脛骨灰分重量指標(biāo)評(píng)價(jià)，1α-OH-D3的生物學(xué)活性接近1,25-(OH)2-D3[2]。但1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)值尚需進(jìn)一步研究確定。

Applegate等（2002）[3]和Goetting-Fuchs等（2012）[4]報(bào)道，肉雞脛骨、股骨和跖骨的生長(zhǎng)和礦化存在差異。 由此推測(cè)，以脛骨、股骨和跖骨礦化指標(biāo)評(píng)價(jià)1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)時(shí)，三者的評(píng)估結(jié)果可能存在差異。因此，本試驗(yàn)以脛骨、股骨和跖骨礦化指標(biāo)為評(píng)價(jià)依據(jù)，評(píng)估1～42日齡肉雞日糧中1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1α-OH-D3由臺(tái)州和泰化學(xué)有限公司惠贈(zèng)；1,25-(OH)2-D3購(gòu)自常州布克化工有限公司。根據(jù)Han等（2012）[5]的方法，將1α-OH-D3或1,25-(OH)2-D3溶于無(wú)水乙醇，待溶解后加入丙二醇，使最終溶液中乙醇與丙二醇比例為5∶95，1α-OH-D3或1,25-(OH)2-D3濃度為10 mg/l。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧

將300只1日齡健康羅斯308肉雞母雛隨機(jī)分為6個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。試驗(yàn)期為42 d。試驗(yàn)設(shè)計(jì)6種日糧，在基礎(chǔ)日糧（鈣0.50%、非植酸磷0.25%、無(wú)維生素D3）中分別添加3個(gè)水平的1α-OH-D3（1.25、2.5、5.0 μg/kg）和 3 個(gè)水平的1,25-(OH)2-D3（1.25、2.5、5.0 μg/kg）?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)肉雞進(jìn)行籠養(yǎng)，1～14日齡和15～42日齡肉雞分別在雛雞籠（70 cm×70 cm×30 cm）和育成籠（200 cm×50 cm×35 cm）飼養(yǎng)。粉狀飼料飼喂，自由采食、飲水。照明設(shè)置：1～21日齡，23 h；22～42日齡，20 h。溫度控制：1～3日齡，33℃，而后每周下調(diào)3℃，直至降至24℃并保持。按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。

1.4 樣品收集與分析

42日齡時(shí)，每重復(fù)取接近該重復(fù)平均體重的1只雞進(jìn)行屠宰試驗(yàn)。屠宰試驗(yàn)中，剝離脛骨、股骨和跖骨。將骨骼放入樣品袋，密封，冷凍保存（-20℃）。

將左脛骨、左股骨或左跖骨在沸水中煮5 min，去除殘余肌肉、腓骨，剝離干凈后，無(wú)水酒精浸泡24 h，無(wú)水乙醚浸泡24 h，除去水分和脂肪。烘箱中105℃烘干24 h，測(cè)定脛骨、股骨或跖骨重量。用游標(biāo)卡尺測(cè)定左脛骨、左股骨或左跖骨長(zhǎng)度和直徑（骨骼長(zhǎng)度1/2處）。將骨骼壓碎，放入坩堝，在馬弗爐中600℃灰化36 h，測(cè)定灰分重量。加入鹽酸溶解，EDTA滴定法測(cè)定鈣含量；鉬黃比色法測(cè)定磷含量。用數(shù)顯萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)測(cè)定右脛骨、右股骨或右跖骨折斷力（即脛骨強(qiáng)度），參數(shù)設(shè)置：跨度40 mm，單位負(fù)荷50 kg，位移速度10 mm/min[6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

以每重復(fù)為試驗(yàn)單元，用SAS 9.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行GLM分析，用Tukey法進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。斜率比法測(cè)定1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)[7]。數(shù)學(xué)模型為y=a+b1x1+b2x2，其中y表示骨骼礦化，x1表示1,25-(OH)2-D3，x2表示1α-OH-D3，b2/b1表示1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)。用多項(xiàng)式比較法評(píng)估1α-OH-D3或1,25-(OH)2-D3與骨骼礦化的線性或二次曲線關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 骨骼礦化（見表2～表4）

表2 1α-OH-D3和1,25-(OH)2-D3對(duì)42日齡肉雞脛骨礦化的影響

表3 1α-OH-D3和1,25-(OH)2-D3對(duì)42日齡肉雞股骨礦化的影響

表4 1α-OH-D3和1,25-(OH)2-D3對(duì)42日齡肉雞跖骨礦化的影響

由表2可見，1α-OH-D3水平線性增加42日齡肉雞脛骨強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度、直徑和灰分重量（P＜0.05）；1,25-(OH)2-D3水平線性增加42日齡肉雞脛骨強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度、直徑和灰分重量（P＜0.05）；1α-OH-D3對(duì)脛骨鈣含量的影響呈現(xiàn)二次曲線形式（P＜0.05），對(duì)脛骨磷含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）；1,25-(OH)2-D3水平對(duì)脛骨鈣和磷含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

由表3可見，1α-OH-D3水平線性增加42日齡肉雞股骨強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度、直徑和灰分重量（P＜0.05）；1α-OH-D3或1,25-（OH）2-D3顯著影響股骨鈣和磷含量（P＜0.05），隨 1α-OH-D3或 1,25-（OH）2-D3水平提高，股骨鈣和磷含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。

由表4可見，1α-OH-D3水平線性增加42日齡肉雞跖骨強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度和灰分重量（P＜0.05）；1,25-(OH)2-D3水平線性增加42日齡肉雞跖骨強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度和灰分重量（P＜0.05）；跖骨直徑和鈣含量隨1α-OH-D3或1,25-(OH)2-D3水平升高呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；隨1α-OH-D3水平升高，跖骨磷含量先增加后降低；1,25-(OH)2-D3對(duì)跖骨磷含量無(wú)顯著影響。

2.2 1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3生物學(xué)效價(jià)比較（見表5）

表5 1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)

由表5可見，以42日齡肉雞脛骨強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度、直徑和灰分重量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，1α-OH-D3生物學(xué)效價(jià)分別是1,25-(OH)2-D3的0.78、0.77、0.93、0.91倍和0.78倍。以42日齡肉雞股骨強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度、直徑和灰分重量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，1α-OH-D3生物學(xué)效價(jià)分別是1,25-(OH)2-D3的0.76、0.84、0.95、0.88倍和0.80倍。跖骨強(qiáng)度隨1,25-(OH)2-D3水平升高先增加后降低，跖骨直徑在各處理間無(wú)顯著差異。因此，跖骨強(qiáng)度和直徑不能作為評(píng)價(jià)1α-OH-D3生物學(xué)效價(jià)的指標(biāo)。以42日齡肉雞跖骨重量、長(zhǎng)度和灰分重量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，1α-OH-D3生物學(xué)效價(jià)分別是1,25-(OH)2-D3的0.82、0.96倍和0.83倍。以42日齡肉雞骨骼礦化指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，1α-OH-D3生物學(xué)效價(jià)約為1,25-(OH)2-D3的0.85倍(各指標(biāo)的均值)。

3 討論

3.1 飼糧鈣、磷及維生素D水平設(shè)計(jì)

維生素D的作用效果受日糧Ca和NPP水平的影響。Han等（2012）[5]報(bào)道，在低Ca（0.4%～0.6%）日糧中，1α-OH-D3增加肉雞脛骨強(qiáng)度、重量和長(zhǎng)度；Ca水平提高至0.8%～1.2%時(shí)，1α-OH-D3對(duì)骨骼生長(zhǎng)的改善作用降低。研究顯示，日糧低磷（NPP 0.21%）時(shí)，1α-OH-D3促進(jìn)肉雞骨骼生長(zhǎng)和礦化[8]；NPP提高至0.29%[9]或0.30%[10]時(shí)，1α-OH-D3未改善脛骨灰分重量和含量。研究表明：在低鈣、低磷日糧中添加維生素D促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)與礦化。因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)低鈣（Ca 0.50%）、低磷（NPP 0.25%）日糧。

研究顯示，肉雞日糧中1α-OH-D3適宜添加量為5 μg/kg[11-12]；1,25-(OH)2-D3適宜添加量為3～5 μg/kg[13-14]。因此，本試驗(yàn)中兩種維生素D的設(shè)計(jì)水平（1.25、2.5、5.0 μg/kg）相對(duì)較低。

3.2 骨骼礦化

研究發(fā)現(xiàn)，1α-OH-D3或維生素D3可改善飼喂低鈣、低磷日糧肉雞的骨骼強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度、直徑和灰分重量[15]。本試驗(yàn)中，1α-OH-D3或 1,25-(OH)2-D3增加脛骨、股骨和跖骨強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度、直徑和灰分重量，表明低鈣、低磷日糧中添加維生素D可促進(jìn)肉雞骨骼發(fā)育。本試驗(yàn)顯示，維生素D對(duì)42日齡脛骨、股骨和跖骨中鈣和磷的含量具有不同程度的影響。此結(jié)果與施傳信等（2013）[16]和王建國(guó)等（2015）[15]研究結(jié)果類似。王建國(guó)等（2015）[15]報(bào)道，維生素D可通過提高骨骼中鈣、磷的沉積量促進(jìn)骨骼礦化。本試驗(yàn)中，隨著骨骼灰分重量的增加，骨骼鈣、磷的沉積量仍然增加。

3.3 1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3生物學(xué)效價(jià)比較

研究顯示，1α-OH-D3的生物學(xué)效價(jià)高于維生素D3[17]，其活性接近于1,25-(OH)2-D3[18]。1α-OH-D3高效生物學(xué)活性的發(fā)揮很可能與其代謝途徑有關(guān)。Paar?en等（1978）[1]報(bào)道，1α-OH-D3不需腎臟1α-羥化酶參與羥基化，它直接在肝臟25-羥化酶作用下快速轉(zhuǎn)化為1,25-(OH)2-D3。Edelstein等（1978）[19]的研究證實(shí)，給公雞注射3H標(biāo)記的1α-OH-D3，可在腸黏膜中迅速生成1,25-(OH)2-D3。

肉雞骨骼灰分重量與含量以及血漿礦物元素濃度等可以作為評(píng)估維生素D相對(duì)生物學(xué)效價(jià)的指標(biāo)。本試驗(yàn)顯示，42日齡肉雞脛骨和股骨的強(qiáng)度、重量、長(zhǎng)度、直徑和灰分重量與1α-OH-D3或1,25-(OH)2-D3水平呈現(xiàn)線性關(guān)系，跖骨重量、長(zhǎng)度和灰分重量與兩種維生素D水平也呈現(xiàn)線性關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，在1～42日齡肉雞飼糧（Ca 0.5%、NPP 0.25%）中，以骨骼礦化指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，1α-OH-D3的生物學(xué)效價(jià)約為1,25-(OH)2-D3的0.85倍。Boris等（1977）[2]報(bào)道，在1～21日齡肉雞日糧（Ca 1.00%，總磷0.70%）中，以脛骨灰分重量為指標(biāo)評(píng)價(jià)，1α-OH-D3活性接近于1,25-(OH)2-D3。但以大鼠體重為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，1α-OH-D3活性僅為1,25-(OH)2-D3的20%～50%[20]。這些研究表明，維生素D相對(duì)生物學(xué)效價(jià)的評(píng)估受試驗(yàn)動(dòng)物種類、日齡、性別、日糧鈣磷水平以及評(píng)價(jià)指標(biāo)等因素的影響。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，以骨骼礦化指標(biāo)評(píng)價(jià)1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3相對(duì)生物學(xué)效價(jià)時(shí)，脛骨（0.83）、股骨（0.85）和跖骨（0.87）的評(píng)估結(jié)果略有不同。表明維生素D相對(duì)生物學(xué)效價(jià)的評(píng)估結(jié)果在不同骨骼間存在一定的差異。

4 結(jié)論

① 1α-OH-D3或1,25-(OH)2-D3可促進(jìn)低鈣、低磷肉雞骨骼的生長(zhǎng)和礦化。

② 1α-OH-D3與1,25-(OH)2-D3相對(duì)生物學(xué)效價(jià)在脛骨、股骨和跖骨間略有差異。

③ 以42日齡肉雞骨骼礦化指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，1α-OH-D3的生物學(xué)效價(jià)約為1,25-(OH)2-D3的0.85倍。