■衛(wèi)旭彪 武如娟 鄭召君 廖秀冬 張日俊

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

抗菌肽廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動物的生物中，按其來源不同可以分為細(xì)菌抗菌肽、植物抗菌肽、昆蟲抗菌肽、兩棲動物抗菌肽等?？咕囊蚱浞肿恿啃?、抗菌譜廣、抗菌活性高、不易產(chǎn)生抗藥性、作用機(jī)理獨(dú)特等多重優(yōu)勢已成為動物和人類醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、飼料（食品）學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，許多抗菌肽不但可以直接抑制細(xì)菌、真菌、寄生蟲以及病毒的生長，而且在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。最新證據(jù)表明，抗菌肽可以作為有效的輔助物，協(xié)同其它免疫因子，強(qiáng)化適應(yīng)性反應(yīng)和促進(jìn)傷口愈合。因此，隨著抗菌肽作用機(jī)制的不斷闡明，將其作為藥物應(yīng)用于人類和畜禽疾病治療的想法將有可能逐步實(shí)現(xiàn)。

1 抗菌肽在宿主防御中的作用

抗菌肽家族的成員廣泛地分布在自然界中，是雙親性的陽離子肽。它們一般被定義為：具有大約12～60個氨基酸，其中包含2～7個帶有正電荷氨基酸殘基并且其中疏水氨基酸占有一定比例。它們折疊成不同的二級結(jié)構(gòu)（通常在插入膜雙分子層后）并帶上電荷和極性，然后疏水的殘基覆蓋在分子的表面。早期對細(xì)菌、真菌以及病毒的研究已經(jīng)表明，這些抗菌肽對不同的微生物有直接的抗菌作用。最近，有學(xué)者又發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對免疫調(diào)節(jié)具有多種作用，而這種免疫調(diào)節(jié)對宿主感染細(xì)菌和炎癥的產(chǎn)生有重要影響。

1.1 抗菌肽與免疫因子共表達(dá)

先天性免疫是最古老的免疫防御方式，它對于脊椎動物和無脊椎動物的宿主防御都很重要。近期發(fā)現(xiàn)的多種免疫因子（尤其是TLRs，Toll-like receptors）在先天免疫系統(tǒng)中呈現(xiàn)出前所未有的復(fù)雜性和多樣性。這些活性很強(qiáng)的免疫因子，在序列和結(jié)構(gòu)上具有很大的差異，但不論在脊椎動物還是無脊椎動物中都有著相似的作用。它們廣泛分布在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞（如白細(xì)胞、帕內(nèi)塔細(xì)胞）和被細(xì)菌感染的組織（如腸道、呼吸道）中。觀察發(fā)現(xiàn)，這些因子在炎癥引起的表達(dá)和分泌中是必要的。

成熟（具有生物活性）肽的表達(dá)與物種、組織類型、細(xì)胞家系及分化水平有關(guān)。基因的表達(dá)和蛋白的分泌由許多因素誘導(dǎo)，比如細(xì)菌產(chǎn)物、損傷或炎癥刺激。例如，當(dāng)單核細(xì)胞接觸細(xì)菌、脂多糖（LPS）或者干擾素-γ（IFN-γ）時，人類β防御素（hBD-1和hBD-2）的表達(dá)會升高；當(dāng)角化細(xì)胞受到腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β)、細(xì)菌或白細(xì)胞介素-22（IL-22）等的刺激時，hBD-2和hBD-3的表達(dá)會升高；而當(dāng)腸道、子宮和呼吸道上皮細(xì)胞被TLR興奮劑刺激時，hBD-1、hBD-2和hBD-3的表達(dá)會升高?？咕木幋a序列的5’端上游有多個潛在一致的序列提供給轉(zhuǎn)錄因子，包括核因子（NF）κB、白細(xì)胞介素-6核表達(dá)因子（NF-IL6）、急性期反應(yīng)因子和IFN-γ反應(yīng)因子。單核細(xì)胞中hBD-2的合成是由IL-1β誘導(dǎo)，而在腸上皮細(xì)胞中是由LPS和肽聚糖誘導(dǎo)，這取決于NFκB。但是在角化細(xì)胞中，由IL-22誘導(dǎo)的hBD-2和hBD-3的表達(dá)取決于轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3。IL-1、TNF-α和TLR等激活劑也可以激活NFκB。哺乳動物中的轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)多重發(fā)炎和免疫基因的轉(zhuǎn)錄。這些信息表明，抗菌肽的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)取決于刺激物和細(xì)胞的類型，并且受到先天免疫和急性炎癥中其它物質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)。

1.2 抗菌肽對細(xì)菌感染的防御作用

在人和小鼠體內(nèi)的試驗(yàn)表明，抗菌肽在免疫中扮演一定的角色。它的表達(dá)與機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的敏感度密切相關(guān)。具有特異性抗體缺乏癥的患者往往會缺乏α-防御素并且遭受嚴(yán)重且頻繁的細(xì)菌感染。另外一些患有柯士文癥的人頻繁遭受口腔細(xì)菌感染和嚴(yán)重的牙周炎，這與人類抗菌肽LL-37和α-防御素的缺乏有關(guān)。LL-37、hBD-2和hBD-3的低水平表達(dá)會導(dǎo)致皮膚對細(xì)菌感染的敏感性增強(qiáng)，進(jìn)而引發(fā)皮膚炎損傷皮膚。相反，當(dāng)患有牛皮癬和支氣管肺泡炎癥時，hBD-2和hBD-3的表達(dá)會相應(yīng)增強(qiáng)。在皮膚角化細(xì)胞中，抗菌肽[LL-37和小鼠體內(nèi)與人源性抗菌肽cathelicidin相關(guān)的抗菌肽（CRAMP）]的表達(dá)隨著感染和損害的不同而不同。

當(dāng)嚙齒動物遭到細(xì)菌侵染后，抗菌肽可以通過控制細(xì)菌的數(shù)量來降低其死亡率。β防御素-1和CRAMP基因消除的小鼠更易于遭受細(xì)菌感染，且也更難于消除。需要指出的是，盡管這些發(fā)現(xiàn)一致表明抗菌肽在宿主防御中扮演著重要角色，但是到底它們是直接殺滅細(xì)菌還是起一個免疫調(diào)節(jié)作用或者二者兼有，尚沒有明確區(qū)分。此外，這些發(fā)現(xiàn)表明，抗菌肽和防御素的表達(dá)與機(jī)體被細(xì)菌感染和發(fā)生炎癥的狀態(tài)有關(guān)。同時也說明了抗菌肽在先天防御、清除、阻止和防御細(xì)菌攻擊方面具有重要作用。

2 直接的抑菌作用

體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對機(jī)體的保護(hù)作用一部分要?dú)w功于大多數(shù)抗菌肽能夠與細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)合。通過對細(xì)胞膜雙分子層進(jìn)行大量局部的作用，會形成許多離子滲透通道，進(jìn)而提高了細(xì)胞的通透性，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。相反，包括美洲鱟素（一種非常有效的馬蹄蟹抗菌肽）在內(nèi)的許多抗菌肽則能夠直接跨過細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的一個或多個陰離子靶標(biāo)作用最終殺死細(xì)菌。實(shí)際上，只要在體外適宜的環(huán)境下，所有的人源性抗菌肽和防御素均有直接的抗菌作用。許多抗菌肽在體外的模擬生理環(huán)境下可以保持殺菌能力，但這經(jīng)常會被生理鹽環(huán)境和單價或多價的離子和血清所破壞。毫無疑問，許多抗菌肽（例如在嗜中性粒細(xì)胞中的α-防御素）需要維持在一個可以保證它們正常發(fā)揮功能的濃度；然而，低的殺菌濃度和與生理鹽的拮抗作用（例如在黏膜上皮細(xì)胞中）一致說明了一些抗菌肽在體內(nèi)還存在著其它的作用方式。

3 免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子

最新發(fā)現(xiàn)表明，在先天性免疫細(xì)胞（如嗜中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞）和連接先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)（如單核細(xì)胞、巨紅細(xì)胞和樹突細(xì)胞（dendritic cells，DCs）），當(dāng)處于肽、鹽和血清的生理濃度下，抗菌肽可以產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)（炎癥反應(yīng)、先天免疫和適應(yīng)性免疫）。哺乳動物宿主防御肽已經(jīng)被證實(shí)可以促進(jìn)、抑制或者補(bǔ)充某些細(xì)胞功能，比如趨藥性、細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞激素的產(chǎn)生。盡管這些生物作用不是直接殺滅細(xì)菌，但是這些生物作用可能也促進(jìn)細(xì)菌的清除。另外，這些證據(jù)表明抗菌肽除了直接殺菌以外還有其它的免疫功能，比如可以抑制一些細(xì)菌誘導(dǎo)的細(xì)胞激素的產(chǎn)生（抗發(fā)炎）、促進(jìn)傷口愈合、增快血管生成和充當(dāng)輔助劑，這些都已經(jīng)在動物和組織模型中得到證明。

4 免疫激活

在感染部位和受傷部位分泌的抗菌肽和抑制素對于效應(yīng)細(xì)胞具有趨化作用，同時也會誘導(dǎo)趨化因子的轉(zhuǎn)錄和分泌，促進(jìn)了先天性免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的密集，促進(jìn)肥大細(xì)胞分泌組胺。同時，這也補(bǔ)充了先天性免疫和適應(yīng)性免疫中對病菌的體液免疫和細(xì)胞免疫的作用。α-防御素、hBD-2、hBD-3和hBD-4是單核細(xì)胞、（記憶和初始）T細(xì)胞及未成熟的DCs的趨化因子。牛、人、鼠和豬的抗菌肽對幾乎所有的體內(nèi)和體外外周的紅細(xì)胞具有趨化作用。例如，LL-37可以誘導(dǎo)IL-8的釋放，而IL-8又可反過來促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化性和高濃度LL-37的釋放。在無脊椎動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。通過趨化作用，循環(huán)血細(xì)胞移動到受傷的部位，并在那里釋放抗菌肽。抗菌肽還可以刺激某些細(xì)胞激素的釋放。例如，一種來自鱟的抗脂多糖因子的肽可以誘導(dǎo)人類外周單核血細(xì)胞中抗病毒激素和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IFN-α、IFN-γ、IL-2和IL-13的釋放。另外，這種肽可以提高經(jīng)致命劑量綠膿假單胞菌處理過小鼠的存活率，而綠膿假單胞桿菌與脾臟和肝臟中TNF-α的減少和IL-2、IL-12和IL-13 mRNA合成的增加有關(guān)。LL-37不但可以誘導(dǎo)人類角化細(xì)胞中IL-6、IL-8、TNF-α、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子及IL-1β的釋放，而且可以增強(qiáng)產(chǎn)LL-37未成熟的DCs中TNF-α和IL-6的分泌。小鼠β-抑制素-2的成熟DCs也分泌促炎的[輔助性T細(xì)胞1（Th1）極化]細(xì)胞激素IL-12、IL-1α和IL-6。

5 炎癥和免疫的抑制

盡管哺乳動物抗菌肽可以直接刺激一些先天免疫作用，被認(rèn)為是促炎（如白細(xì)胞的趨化反應(yīng)和細(xì)胞激素、趨化因子及組胺的誘導(dǎo)釋放）。但是，它們同時能夠保護(hù)宿主免受有害的、潛在的致命因子的作用，尤其是由過量的TLR誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)?？咕牟坏梢砸种拼傺准に兀ㄈ鏣NF-α和IL-6）基因的轉(zhuǎn)錄以及由脂多糖和其它細(xì)菌產(chǎn)物誘導(dǎo)的促炎傳遞因子的釋放，還可以阻止嚙齒動物在遭受細(xì)菌感染后敗血癥的發(fā)生?？咕闹泻图?xì)胞內(nèi)毒素的行為也揭示了其可維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，尤其是在富含共生體的腸區(qū)域和阻止過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生。此外，它會阻止那些引發(fā)強(qiáng)烈組織損傷和炎癥的有毒成分的釋放（例如，富含脯氨酸-精氨酸的豬抗菌肽PR-39可以抑制活性氧的產(chǎn)生；而牛骨髓抗菌肽-28促進(jìn)被感染的淋巴細(xì)胞的凋亡），并且有效促進(jìn)組織再生。總之，人源抗菌肽促進(jìn)細(xì)胞增殖、分裂和受傷修復(fù)。抗菌肽的這種中和和調(diào)節(jié)作用使宿主免遭炎癥反應(yīng)中有害成分的破壞。

6 增強(qiáng)免疫

許多跡象表明，抗菌肽可以將先天性免疫和適應(yīng)性免疫連接起來，調(diào)節(jié)DC的功能和特異的抗原免疫反應(yīng)。LL-37可以誘導(dǎo)以單細(xì)胞為主要來源的DCs分化，增強(qiáng)其內(nèi)吞能力，調(diào)節(jié)具有吞噬作用的受體的表達(dá)和功能的發(fā)揮，提高協(xié)同刺激分子的表達(dá)（CD86），并增加通過LPS刺激DCs而產(chǎn)生的Th1細(xì)胞激素的分泌。同樣地，小鼠BD2刺激DC的成熟和協(xié)同刺激分子（CD40、CD80和CD86）、主要的組織相容性復(fù)合體系列Ⅱ和趨化因子受體CCR7（CCR7可以控制與富含T細(xì)胞的區(qū)域之間的交流）的表達(dá)。通過這種方式，抗菌肽也許可以增強(qiáng)適應(yīng)性免疫的許多方面，促進(jìn)某些細(xì)胞系的分化，改變細(xì)胞激素環(huán)境。這反過來強(qiáng)化了這種反應(yīng)。IL-22提高了角化細(xì)胞中hBD-2和hBD-3的表達(dá)，增加了Th2細(xì)胞中IL-4的釋放，促進(jìn)了主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ抗原和急性期蛋白的表達(dá)。過敏性皮膚炎患者皮膚中hBD-2和hBD-3 mRNA的低水平表達(dá)與Th2細(xì)胞激素表達(dá)的提升有關(guān)。這些信息表明，適應(yīng)性免疫的一些方面與宿主抗菌肽的表達(dá)和潛在功能與適應(yīng)性免疫密切相關(guān)。另外，LL-37可以和一些細(xì)胞激素協(xié)同發(fā)揮作用，比如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和IL-1β,這使得低濃度的肽也可以發(fā)揮免疫效應(yīng)。作為輔助劑，LL-37、CRAMP和小鼠BD2可以增強(qiáng)特異性抗原的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。這些肽可以作為有效的輔助因子發(fā)揮各種作用，包括補(bǔ)充、促分化和激活感染部位的效應(yīng)細(xì)胞。然而，迄今為止，這些肽對淋巴細(xì)胞功能發(fā)揮（B細(xì)胞激活和抗體產(chǎn)生、細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的殺傷作用和輔助細(xì)胞的功能）的作用文獻(xiàn)中少有報道。

7 免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

抗菌肽的生物效應(yīng)，跟它們的表達(dá)和分泌類似，通常是在炎癥刺激下產(chǎn)生（包括內(nèi)源性和致病性來源的微生物保守成分）且受一定生理環(huán)境的影響，包括抗菌肽的濃度、胞內(nèi)環(huán)境和胞外可溶解物質(zhì)成分。抗菌肽的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制也有許多種，包括直接與內(nèi)毒素LPS、已知的或假設(shè)的細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)信號分子或受體結(jié)合。據(jù)報道，人源抗菌肽可以和許多受體結(jié)合，激活分裂酶原的蛋白激酶通路的成分，促進(jìn)Ca2+的轉(zhuǎn)移，結(jié)合到含SH3位點(diǎn)的蛋白質(zhì)上并抑制LPS誘導(dǎo)的NFκB的移位。人源抗菌肽的這種受體-配體的相互作用并不是很好理解。抗菌肽的許多功能依賴已知的受體（如LL-37通過甲酰肽類受體直接調(diào)節(jié)人外周血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和T細(xì)胞），但它們的另外一些生物功能與這些已知的受體沒有關(guān)系。

8 治療

具有很遠(yuǎn)進(jìn)化關(guān)系的不同物種的抗菌肽具有類似的功能表明，人類可以通過對脊椎動物和無脊椎動物的研究來設(shè)計一個適用于人類的新的抗病原體感染藥劑的模板。盡管目前研究尚淺，但是越來越多關(guān)于天然和合成的哺乳動物抗菌肽免疫調(diào)節(jié)作用的報道正不斷涌現(xiàn)出來，包括對LPS的中和、對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的引導(dǎo)以及對基因轉(zhuǎn)錄和活性氧釋放的促進(jìn)作用。隨著應(yīng)用抗菌肽magainin開發(fā)的抗菌肽藥品MAI278已經(jīng)接近完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，許多公司都開始急切地想把宿主防御肽變成一種新型的抗菌治療藥物?？咕脑诓煌奈锓N間有功能性的冗余，具有防腐和抗菌的作用，還具有輔助功能和低毒性，這些特點(diǎn)使它成為一種極具吸引力的治療藥劑。此外，對各種抗菌肽不同活性區(qū)域的準(zhǔn)確定位（證明具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)作用）也進(jìn)一步使得研發(fā)具有潛在的特異功能的抗菌肽成為可能。

9 結(jié)論

總之，新的證據(jù)表明抗菌肽積極參與宿主免疫防御的各個階段，既可以通過直接殺滅方式發(fā)揮抗菌作用，也可以在炎癥和免疫反應(yīng)或者控制和消除炎癥反應(yīng)中，通過與聯(lián)接先天性免疫和適應(yīng)性免疫的系統(tǒng)細(xì)胞間進(jìn)行交流來刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞的生物功能。

更多的一些關(guān)于抗菌肽的詳細(xì)研究將幫助我們更好地理解這些肽是如何識別和中和那些病原體的，這將會幫助我們建立一個新的抗感染的治療策略。這些研究通過闡明抗菌肽的作用機(jī)理，既可以拓展我們目前對抗菌肽結(jié)構(gòu)-功能研究的范圍，又可以促進(jìn)對于抗菌肽免疫調(diào)節(jié)功能的報道。最重要的是，未來將可在與生理環(huán)境有關(guān)的條件下開拓和建立關(guān)于抗菌肽不同性質(zhì)的各種研究，并且最終在體內(nèi)確認(rèn)抗菌肽的功能，以保護(hù)宿主免受細(xì)菌的感染并抑制潛在的有害炎癥的發(fā)生。

（參考文獻(xiàn)53篇，刊略，需者可函索）