■邱 玲 祝 呂 張歡歡 李雄飛 張劍

（武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

棉粕蛋白經(jīng)微生物多菌種發(fā)酵和低濃度硫酸酸解后，水解液中除含有種類多、品種全的氨基酸外，還含有硫酸、銨鹽和色素。為了綜合利用水解液，有必要對其深加工。

復(fù)合氨基酸螯合鈣是一種既補氨基酸又補鈣的雙重營養(yǎng)制劑，具有穩(wěn)定性好、適口性優(yōu)、生物效價高、與維生素無配伍禁忌等優(yōu)點；同時，還具有吸收快、抗病、抗應(yīng)激性等特點[1-2]，因此，受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。

本文以棉粕蛋白水解液為原料，先用碳酸鈣作降酸、降硫處理，隨后，通過考察活性炭的5種預(yù)處理方法對水解液的脫色效果，優(yōu)化了棉粕蛋白水解液的脫色條件。經(jīng)脫色后的水解液繼續(xù)用碳酸鈣中和至pH值3.8，按α-氨基氮與鈣2∶1的比例調(diào)配，在合適條件螯合。產(chǎn)品經(jīng)分離純化，得到復(fù)合氨基酸螯合鈣純品。這些工作對指導(dǎo)復(fù)合氨基酸螯合鈣的生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：棉粕蛋白水解液(由武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院高冰教授提供，主要通過食用曲霉、釀酒酵母以及芽孢菌協(xié)同發(fā)酵[3]，再經(jīng)低濃度硫酸水解而成)、活性炭（粒狀，AR)、硼酸（AR）、氧化鎂（AR）、鄰苯二甲酸氫鉀（AR）、碳酸鈣（科密歐試劑，AR）、棉酚對照品（購買于上海信裕生物科技有限公司，純度≥98%），標準氨基酸（國藥試劑，AR），其他試劑均為分析純。

儀器：日立氨基酸分析儀（L8800)、MDS-6微波消解儀（新儀微波化學(xué)科技有限公司）、HPLC（Vari?an）、pHS-3C雷磁數(shù)字酸度計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、7200可見分光光度計(UNICO儀器有限公司)、DF-101B集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、WXL-5馬弗爐(鶴壁天弘儀器)、DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、BS224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 分析方法

①棉粕水解液中氨基氮和揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)定量按如下方法操作：取一定量水解液，用氫氧化鈉溶液中和，再分別按2,4,6-三硝基苯磺酸法[4]和氧化鎂水蒸氣蒸餾法[5]測定。水解液中的氨基酸按González-Vega J.C等方法[6]定量。經(jīng)CaCO3處理過的水解液中的氨基氮和揮發(fā)性鹽基氮，按文獻[4-5]直接定量。

②脫色率計算：在410 nm處分別測定經(jīng)脫色材料處理前后水解液的吸光度，按下式計算脫色率：

D（%）=（A0-A）×100/A0。

式中：D——脫色率（%）；

A0——脫色前水解液的吸光度；

A——脫色后水解液的吸光度。

③復(fù)合氨基酸螯合鈣樣品分析[包括棉酚、還原糖、揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）、Ca2+、Cl-、SO42-等成分分析]

將樣品用鹽酸溶解后，溶解物中的棉酚含量按文獻[7]定量；還原糖測定按DNS試劑法[8]；揮發(fā)性鹽基氮按氧化鎂水蒸氣蒸餾法定量。復(fù)合氨基酸螯合鈣樣品中Ca2+、SO42-、Cl-分析需將樣品先消化，再定量。

消化操作如下：取樣品0.2 g，置于消解罐，分別加入5 ml濃硝酸和4 ml 30%H2O2，按表1設(shè)置微波消解儀參數(shù)，開始消化。樣品消化好后，用超純水定容至 100 ml。取樣 10 ml，用于分析 Ca2+、SO42-、Cl-含量。鈣含量測定采用絡(luò)合滴定法；硫酸根定量采用重量法；氯離子測定采用莫爾法。

表1 消解樣品時微波消解儀設(shè)置的參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 棉粕水解液成分分析（見表2～表3）

表2 棉粕水解液主要成分

表3 棉粕水解液中氨基酸組成與分布(mg/100 ml)

由表2和表3可知，棉粕水解液除含有18種氨基酸外，還含有大量的氫離子、硫酸根離子、揮發(fā)性鹽基氮等副產(chǎn)物。為綜合利用水解液，有必要將副產(chǎn)物除去。為了實現(xiàn)上述目標，棉粕水解液需首先經(jīng)降酸、降硫處理。

2.2 棉粕水解液的初步降酸、降硫（見表4）

表4 中和至pH值2.0時的棉粕水解液參數(shù)

表4給出了棉粕水解液經(jīng)CaCO3中和至pH值2.0的有關(guān)參數(shù)。經(jīng)CaCO3中和至pH值2.0后，水解液中氨基氮損失小。經(jīng)初步降酸與降硫后，可討論對水解液的脫色處理。

2.3 活性炭預(yù)處理方法對水解液脫色效果

活性炭的預(yù)處理：取過40目篩的活性炭5份，每份重5 g。分別用30 ml蒸餾水、2 mol/l硝酸、2 mol/l硫酸、2 mol/l氫氧化鈉、飽和Ca(OH)2溶液浸泡24 h。抽濾后，用蒸餾水將活性炭洗至中性，再用濾紙壓干，于70℃通風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，以考察它們對中和至pH值2.0的棉粕水解液的脫色效果。

取pH值2.0的水解液6份，每份30 ml。分別用2.5 g預(yù)處理過的活性炭處理，處理條件為：70℃下以200 r/min攪拌20 min。經(jīng)處理后的水解液有關(guān)參數(shù)見表5。

表5 預(yù)處理活性炭方法對水解液脫色的影響

經(jīng)NaOH處理過的活性炭脫色效果最佳，脫色率達23%，H2SO4次之，Ca(OH)2再次之，HNO3的脫色效果最差。就氨基酸回收率而言，經(jīng)H2SO4處理過的活性炭，α-氨基氮回收率高達96%，經(jīng)蒸餾水浸泡處理的回收率最低。這是因為活性炭經(jīng)H2SO4處理時吸附了部分磺酸基，它們能與色素形成氫鍵。而在酸性環(huán)境條件下氨基酸帶正電荷，難與磺酸基結(jié)合，故損失少?？梢?，用H2SO4預(yù)處理活性炭為最佳選擇。

2.4 水解液脫色條件優(yōu)化

為了進一步優(yōu)化硫酸預(yù)處理活性炭的脫色條件，分別考察了處理活性炭硫酸濃度、活性炭用量、熱處理溫度、時間以及水解液初始酸度5個單因素。

2.4.1 預(yù)處理活性炭硫酸濃度

取經(jīng)不同濃度硫酸預(yù)處理過的活性炭（干重）2.5 g，對pH值2.0的棉粕水解液于70℃攪拌下處理20 min。經(jīng)處理后的水解液有關(guān)參數(shù)見表6。

表6 經(jīng)硫酸預(yù)處理過的活性炭對水解液的處理

由表6可知，當預(yù)處理活性炭硫酸濃度從1.0 mol/l增加到2.0 mol/l時，脫色率由11%增加到22%，繼續(xù)增加硫酸濃度，對脫色的貢獻不大。這是因為硫酸濃度為2.0 mol/l時，活性炭吸附的磺酸基趨于飽和，所以，對吸附色素量也趨于一個飽和值?；钚蕴款A(yù)處理所用硫酸濃度對α-氨基氮的回收率影響不大，這是因為在酸性條件下負載在活性炭上的磺酸基難以與氨基酸結(jié)合。由此可見，預(yù)處理活性炭所用H2SO4濃度以2.0 mol/l為宜。

2.4.2 預(yù)處理活性炭用量

固定熱處理溫度和時間分別為70℃、20 min不變，預(yù)處理活性炭用量對pH值2.0的棉粕水解液的處理結(jié)果見表7。

表7 活性炭用量對水解液的處理結(jié)果

預(yù)處理活性炭的用量對α-氨基氮的回收率影響不大，但影響脫色效果。當改性活性炭用量從1.0 g增加到2.5 g時，脫色率從5%增加到22%，繼續(xù)增加活性炭不改變脫色效果。所以，預(yù)處理活性炭用量選2.5 g為宜。

2.4.3 處理時間

處理時間對脫色效果的影響見表8。

表8 處理時間對脫色效果的影響（%）

當處理時間低于20 min，脫色率低，這是因為在短的接觸時間內(nèi)不可能實現(xiàn)活性炭對色素的完全吸附。在20～40 min內(nèi)，脫色效果最好，活性炭對色素的吸附量趨于飽和。當處理時間大于40 min時，脫色效果反而降低，這是因為在高溫下處理時間過長會加劇氨基酸的縮合，使色度加深。為此，對棉粕水解液處理的時間定為20 min為宜。

2.4.4 水解液初始酸度

固定待處理水解液量（30 ml）、改性活性炭用量（2.5 g）、處理溫度（70℃）和時間（20 min）等參數(shù)不變，考察了水解液初始酸度對脫色的影響（見表9）。

表9 棉粕水解液初始酸度對脫色的影響

就脫色率而言，pH值2.0的處理效果最佳，其次是pH值1.0，再次是pH值3.0，pH值7.0的處理效果最差。就氨基氮的回收率而言，pH值2.0時回收率高達96%，pH值1.0的處理效果與pH值2.0接近，其他酸度條件下α-氨基氮的回收率較低。這是因為在酸性條件下水解液中的色素能被附著在活性炭上的磺酸基有效吸附，而氨基酸帶正電荷，難與磺酸基形成氫鍵。在中性或弱酸性條件下，磺酸基對色素的吸附能力弱；而氨基酸大多呈電中性，以氫鍵的形式被附著在活性炭上的磺酸基吸附。隨著酸性減弱，揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）由NH4+逐步轉(zhuǎn)化為NH3，與磺酸基結(jié)合成鹽，導(dǎo)致經(jīng)處理后的水解液中揮發(fā)性鹽基氮有一個快速下降。因此，為了保證高脫色率和高氨基氮回收率，水解液初始酸度選pH值2.0。

2.4.5 處理溫度

保持其他條件不變，溫度對棉粕蛋白水解液處理的影響見表10。當處理溫度從30℃升至70℃時，脫色率由11%增加到22%，但溫度高于70℃時，脫色率反而下降。這是因為在低溫條件下活性炭對色素的吸附速率慢；而高溫會加劇氨基酸縮合，使水解液色澤加深。溫度對氨基氮回收率影響趨勢與脫色率一致，但溫度對揮發(fā)性鹽基氮的影響甚微。由此可知，在70℃處理水解液，可獲得最佳脫色效果和高氨基酸回收率。

表10 溫度對棉粕水解液的處理效果

2.5 對水解液作進一步降酸、降硫處理

為了進一步降低水解液總酸度和硫酸根含量，向90 ml的上述處理液中繼續(xù)添加碳酸鈣，調(diào)水解液酸度至pH值3.8。濾去沉淀后，得濾液42 ml。此時，濾液的主要成分見表11。與表1相比，棉粕水解液的總酸度、硫酸根大幅下降，α-氨基氮回收率高，但濾液中仍含有大量的揮發(fā)性鹽基氮（NH4+）、硫酸根，需作進一步處理。

表11 棉粕水解液（pH值3.8）的主要成分

2.6 復(fù)合氨基酸螯合鈣的制備

參照文獻[9]描述的復(fù)合氨基酸螯合鈣的優(yōu)化制備方法，略作改動。取pH值3.8的棉粕水解液40 ml，用NaOH調(diào)pH值至8.0，按Ca與α-氨基氮的摩爾比1∶2緩慢添加CaCl2，于50℃以200 r/min攪拌30 min，完成鈣與復(fù)合氨基酸螯合。

復(fù)合氨基酸螯合鈣的精制：將上述螯合物于4 000 r/min離心15 min。棄去上清液，固形物用40 ml無水乙醇浸泡24 h，以除去還原糖和未螯合的鈣離子等雜質(zhì)（因為還原糖在乙醇中溶解度大，而氯化鈣能與乙醇形成配合物）。過濾后，沉淀物經(jīng)2 mol/l鹽酸溶解，濾去不溶物，濾液再用氫氧化鈉調(diào)pH值至8.0。

重復(fù)上述操作，直至沉淀物完全溶于2 mol/l鹽酸。隨后，用氫氧化鈉調(diào)pH值8.0。離心分離出沉淀后，固形物再用無水乙醇洗滌至無氯離子檢出。取出固形物，將其置于50℃通風(fēng)干燥箱中風(fēng)干30 min，稱重，得淺米黃色產(chǎn)品0.828 5 g。

樣品分析：取0.200 0 g樣品，經(jīng)鹽酸溶解后，定容至100 ml。取樣分析棉酚、還原糖、揮發(fā)性鹽基氮（NH4+）含量。結(jié)果表明，上述未見檢出。

另取0.200 0 g樣品，經(jīng)濃硝酸和30%H2O2消化后，定容至100 ml。分別測定樣品中SO42-、Cl-、Ca2+含量。經(jīng)分析未見SO42-、Cl-檢出，鈣含量0.027 5 g（6.868×10-4mol），占13.7%。另外，由表3列出的棉粕水解液中氨基酸組成與含量，可求出棉粕水解液中復(fù)合氨基酸的平均分子量為128.5 g/mol。設(shè)經(jīng)處理后的水解液中的復(fù)合氨基酸的平均分子量維持不變，可推算出螯合物中復(fù)合氨基酸的物質(zhì)的量為1.343×10-3mol，是Ca2+物質(zhì)的量1.96倍?？梢?，Ca2+與氨基酸的螯合比為1∶2，經(jīng)上述工藝制備出的復(fù)合氨基酸螯合鈣純度非常高，可以作為飼料添加劑使用。

3 結(jié)論

棉粕水解液經(jīng)CaCO3中和至pH值2.0后，再用經(jīng)2.0 mol/l H2SO4預(yù)處理24 h的活性炭脫色。脫色后的水解液用CaCO3繼續(xù)中和至pH值3.8，按Ca與α-氨基氮摩爾比0.5補加Ca2+，于pH值8.0和50℃條件下以200 r/min攪拌30 min，完成鈣與復(fù)合氨基酸螯合。經(jīng)分離純化后，含Ca2+量13.7%，Ca2+與α-氨基氮螯合比1∶2，產(chǎn)品不含棉酚等副產(chǎn)物。