■廖明玲 劉晨敏 孫愛杰 任同軍

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連 116013；2.濟(jì)南大學(xué)泉城學(xué)院，山東蓬萊 265600）

近年來，刺參病害報道逐漸增多，由燦爛弧菌(Vibrio splendidus)引起的細(xì)菌性傳染病具有較大的危害性[1-2]。一種稱為“腐皮綜合癥”的疾病已見報道，稚參、幼參及成參階段均見發(fā)病，其癥狀為：患病刺參體壁失去彈性、皮膚潰爛、骨片散落。相關(guān)研究指出刺參“腐皮綜合癥”的致病菌可能是弧菌（Vibm）與假單胞菌（Pseudomonas）[2-4]。蟲草培養(yǎng)基（CMC）是指用大米、小麥等進(jìn)行蛹蟲草人工培植，子實體采收后，長滿菌絲體的培養(yǎng)基殘基。蛹蟲草多糖主要存在于蛹蟲草菌絲中，人工培植CMC含蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸及多種氨基酸、微量元素及維生素等營養(yǎng)成分[5]，作為飼料添加劑能提高肉雞增重率，并顯著增強(qiáng)其免疫力[6]。目前，蛹蟲草的工廠化大規(guī)模生產(chǎn)多以大米為培養(yǎng)基質(zhì)，采用自控發(fā)酵罐，人工培植技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟。然而其蛹蟲草被采收后，仍殘留大量蛹蟲草菌絲的培養(yǎng)基殘基多被丟棄，對其的研究利用鮮見報道，僅現(xiàn)于功能性醬油的釀造[7]、大鼠生長及繁育的影響[8]等少數(shù)領(lǐng)域，在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的研究利用相對匱乏。本試驗研究了飼料中添加CMC對人工感染燦爛弧菌后刺參非特異性免疫指標(biāo)及腸道菌群數(shù)量的影響，以期為CMC在刺參養(yǎng)殖方面的應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從1 000只刺參幼參（大連金州養(yǎng)殖場）中隨機(jī)選取大小相等、體色鮮亮、體質(zhì)健壯的刺參共360只[初始體重為（1.06±0.37）g]進(jìn)行試驗。

CMC由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所提供，由營口市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所測定蟲草素及腺苷含量。

燦爛弧菌(Vibrio splendidus)由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所提供。將2次活化的燦爛弧菌接種在2216 E培養(yǎng)基上，于37℃下培養(yǎng)48 h，用3 ml無菌生理鹽水將菌落沖下制成弧菌懸液，取1 ml梯度稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整至濃度為107cells/ml。

1.2 試驗飼料

以馬尾藻、魚粉、酵母粉和纖維素為主要原料，分別添加0%、5%、10%及15%的CMC干粉，制成4種試驗飼料（試驗飼料配方及營養(yǎng)成分實測值見表1），即試驗分為D1、D2、D3、D4組。飼料原料經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎至180目（粒徑為80 μm）以上，逐級混合均勻后，加入30%～40%水，再次混合均勻，后用制粒機(jī)擠壓制成顆粒飼料（直徑為1.8 mm），置于60℃烘箱烘干至恒重，裝袋置于-20℃冰箱中備用。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗刺參到達(dá)實驗室后先置于2個200 L水槽中暫養(yǎng)7 d，待刺參適應(yīng)實驗室環(huán)境并能正常攝食配合飼料后開始養(yǎng)殖試驗。試驗共設(shè)置4個處理組，每處理組3個平行，共12個水槽（40 L），每槽30只刺參。養(yǎng)殖期間，每天換水1次，換水量為1/2～1/3，同時清理糞便和收集殘餌；每天16：00投餌1次（起始投餌量3%），根據(jù)攝食情況，相應(yīng)調(diào)節(jié)投餌量，以刺參完全攝食并略有剩余為適。試驗于大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室進(jìn)行，養(yǎng)殖試驗持續(xù)28 d。養(yǎng)殖期間，海水pH值7.9～8.4，鹽度30‰～31‰，通過空調(diào)控溫，使水溫保持在15～17℃，全天氣泵充氧，全天進(jìn)行避光處理。

表1 試驗飼料配方及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4 刺參人工感染燦爛弧菌

28 d養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每個水槽中隨機(jī)取出10只刺參用作免疫指標(biāo)及腸道菌群數(shù)量的分析，其余刺參用作人工感染燦爛弧菌試驗，通過體腔注射濃度為107cells/ml的燦爛弧菌0.5 ml。人工感染燦爛弧菌后，將各處理組三個平行的刺參合并在一個水槽中進(jìn)行養(yǎng)殖，即共4個水槽，并繼續(xù)投喂相應(yīng)處理組飼料。

1.5 樣品收集及指標(biāo)測定

人工感染燦爛弧菌前（第0 d），測定刺參腸道菌群數(shù)量（腸道總菌數(shù)，TBC；腸道弧菌數(shù)，VBC）。第0 d及感染后的第1、3、5及7 d，分別對刺參體腔細(xì)胞吞噬率（PC），體腔液酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）及溶菌酶（LZM）活性進(jìn)行測定；并在第7 d再次對腸道菌群數(shù)量進(jìn)行測定。

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每個處理組中隨機(jī)取出6只刺參進(jìn)行免疫指標(biāo)的測定。取出的刺參置于冰盤上進(jìn)行體腔液的采集，于4℃、3 000×g低溫冷凍離心機(jī)中離心10 min，取上清液分裝于1.5 ml Eppendorf離心管中，置于-80℃冰箱中備用，用作體腔液免疫指標(biāo)的測定。

PC的測定參照Chen等及Long等（2005）[9-10]所述中性紅方法，并稍作修改。刺參體腔液離心后，取下層沉淀用生理鹽水稀釋，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，直至稀釋至106cells/ml。取0.2 ml稀釋液與2 ml無菌生理鹽水混勻，加入12孔細(xì)胞板中，在25℃下培養(yǎng)50 min，去除上清液，再加入2 ml 0.001 M中性紅溶液染色，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，后用生理鹽水小心沖洗3次，再加入2 ml乙醇/醋酸混合液，靜置20 min，于540 nm下測定吸光度值。

ACP、AKP、LZM及SOD活性均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。ACP和AKP活性單位定義為：每克樣品蛋白在37℃與基質(zhì)反應(yīng)30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個酶活性單位（U）；LZM活性單位定義為：以其透光率在每分鐘內(nèi)的下降速率定義為1個酶活性單位（U）；SOD活性單位定義為：每毫克樣品蛋白在1 ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量為1個酶活性單位（U）。

刺參腸道菌群的分析參照Li等[11]所述方法。各處理組分別取三只刺參，用消毒的手術(shù)刀解剖獲得其腸道，用勻漿器進(jìn)行勻漿，并用無菌生理鹽水對勻漿液稀釋（通過預(yù)試驗確定稀釋倍數(shù)）。取0.1 ml稀釋液在兩種培養(yǎng)基上涂布。其中，2216E培養(yǎng)基用來測定腸道TBC[12]，TCBS培養(yǎng)基用來測定腸道VBC[13]。在28℃下培養(yǎng)24 h后，對培養(yǎng)基上長出的菌落進(jìn)行計數(shù)，細(xì)菌的總數(shù)用菌落形成單位（CFU）表示。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，利用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，單因素方差分析進(jìn)行組間顯著性檢驗，若差異顯著（P＜0.05），則做Duncan's法多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞吞噬率(見圖1)

由圖1可知，投喂添加CMC飼料28 d后，即人工感染燦爛弧菌前，試驗刺參PC隨著飼料CMC水平的升高，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，但各處理組間差異不顯著(P＞0.05)。刺參人工感染燦爛弧菌后，第1 d，各處理組PC均有所降低，D3與D4處理組顯著高于D1與D2處理組(P＜0.05)；第3～5 d，各處理組PC較第1 d有不同程度地升高，但其處理組間差異不顯著(P＞0.05)；第7 d，D3處理組PC顯著高于D4處理組(P＜0.05)，其余各處理組間差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 飼料蟲草培養(yǎng)基水平對人工感染燦爛弧菌后刺參細(xì)胞吞噬率的影響

2.2 酸性磷酸酶活性(見圖2)

圖2 飼料蟲草培養(yǎng)基水平對人工感染燦爛弧菌后刺參體腔液酸性磷酸酶活性的影響

由圖2可知，人工感染燦爛弧菌前后，D3處理組刺參體腔液ACP活性均高于其它處理組，各處理組間ACP活性變化較大。人工感染燦爛弧菌前（第0 d），D3處理組ACP活性顯著高于D1與D2處理組(P＜0.05)；人工感染燦爛弧菌后，第1 d，D3處理組ACP活性顯著高于D1與D2處理組(P＜0.05)；第3 d，D3處理組ACP活性顯著高于D1與D4處理組(P＜0.05)，其余各處理組間無顯著性差異(P＞0.05)；第5 d，只有D1處理組ACP活性顯著低于D3處理組(P＜0.05)，其余各處理組間差異不顯著(P＞0.05)；第7 d時，D3處理組ACP活性顯著高于其它三個處理組(P＜0.05)。

2.3 堿性磷酸酶活性(見圖3)

由圖3可知，人工感染燦爛弧菌前（第0 d），D4處理組刺參體腔液AKP活性最高，D3處理組次之，且顯著高于其它兩個處理組(P＜0.05)。人工感染燦爛弧菌后，第1 d，D4處理組AKP活性明顯降低，D2與D3處理組AKP活性顯著高于D1與D4處理組(P＜0.05)；第3～5 d，各處理組刺參AKP活性差異均不顯著(P＞0.05)；第7 d，D3處理組AKP活性最高，但與其它三個處理組相比并無顯著性差異(P＞0.05)。

2.4 溶菌酶活性(見圖4)

圖4 飼料蟲草培養(yǎng)基水平對人工感染燦爛弧菌后刺參體腔液溶菌酶活性的影響

由圖4可知，人工感染燦爛弧菌前（第0 d），D3處理組刺參體腔液LZM活性最高，顯著高于其它三個處理組(P＜0.05)；人工感染燦爛弧菌后，第1 d，各處理組間LZM活性變化趨勢不變，D3處理組LZM活性顯著高于D1處理組(P＜0.05)，其余各處理組間無顯著性差異(P＞0.05)；第5 d，D2與D4處理組LZM活性顯著高于D1處理組(P＜0.05)；LZM活性在第3 d與第7 d時各處理組間無顯著差異(P＞0.05)，但總體而言，第7 d時LZM活性高于第1～5 d。

2.5 超氧化物歧化酶活性(見圖5)

圖5 飼料蟲草培養(yǎng)基水平對人工感染燦爛弧菌后刺參體腔液超氧化物歧化酶活性的影響

由圖5可知，隨著飼料CMC水平的升高，刺參體腔液SOD活性變化趨勢并不明顯。人工感染燦爛弧菌前（第0 d），D4處理組SOD活性最高，顯著高于D1與D2處理組(P＜0.05)，其余各處理組間無顯著性差異(P＞0.05)；人工感染燦爛弧菌后，第1 d，D4處理組SOD活性仍然最高，顯著高于D1處理組(P＜0.05)，隨著飼料CMC水平的升高，SOD活性呈上升趨勢；第3～7 d，各處理組間的SOD活性無明顯變化。

2.6 腸道微生物菌落(見圖6)

由圖6可知，人工感染燦爛弧菌前，D3處理組刺參腸道TBC最低，顯著低于其它三個處理組(P＜0.05)；人工感染燦爛弧菌后，各處理組TBC均有所升高，但各處理組間差異不顯著(P＞0.05)。人工感染燦爛弧菌前，D4處理組刺參腸道VBC最高，顯著高于D2與D3處理組(P＜0.05)；人工感染燦爛弧菌后，各處理組VBC均有所升高，但其處理組間并無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 免疫指標(biāo)影響

多糖免疫增強(qiáng)劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已得到較為廣泛的應(yīng)用，很多研究也報道了不同種類多糖飼料添加劑對水產(chǎn)動物呼吸爆發(fā)活力、PC、LZM活性、酚氧化酶活性（PO）等免疫因子的影響作用。向梟等[14]研究指出，飼料中添加黃芪多糖可提高齊口裂腹魚血清中ACP、AKP、LZM及SOD活性。孫虎山等[15]對櫛孔扇貝的研究同樣表明，飼料中添加脂多糖能提高櫛孔扇貝血清和血細(xì)胞中LZM、ACP、AKP、SOD、PO、髓過氧化物酶（MPO）及過氧化氫酶（CAT）的活性。此外，云芝多糖[16]、茯苓多糖[17]、滸苔多糖[18]也能不同程度提高水產(chǎn)動物血清中LZM活性。刺參特異性免疫機(jī)制不完善，主要依靠非特異性免疫來提高對疾病的抵抗力，其體腔細(xì)胞PC，體腔液LZM、SOD、AKP及ACP活性是反映機(jī)體免疫能力的重要非特異性免疫指標(biāo)，在機(jī)體防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。劉云等[19]和孫永欣[20]研究指出，飼料中添加黃芪多糖、海藻硫酸多糖及殼聚糖，能顯著提高刺參體腔細(xì)胞PC，體腔液LZM、SOD、AKP及ACP活性。

圖6 飼料蟲草培養(yǎng)基水平對人工感染燦爛弧菌后刺參腸道菌群的影響

本試驗中，刺參人工感染燦爛弧菌前，當(dāng)飼料蟲草培養(yǎng)基水平為10%～15%時，各項免疫指標(biāo)均達(dá)到最高水平，這與孫永欣等[21]研究結(jié)果相符。刺參投喂添加CMC飼料28 d后，刺參體腔細(xì)胞PC，體腔液LZM、SOD、AKP及ACP活性均有不同程度提高。這與Wang等[22]和孫永欣[20]在刺參飼料中添加黃芪多糖的研究結(jié)果相似。人工感染燦爛弧菌后，各項免疫指標(biāo)隨時間的推移而發(fā)生變化，不同指標(biāo)開始下降的時間略有不同，其中PC與LZM、SOD活性均是從第1 d開始下降，而ACP與AKP活性則是從第3 d才開始下降，并且在第7 d開始恢復(fù)或已恢復(fù)至感染前水平。Wiens等[23]對虹鱒進(jìn)行魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）感染，感染后第1、3、5 d和7 d，分別測定虹鱒體內(nèi)免疫相關(guān)基因的變化，結(jié)果表明，耶爾森氏菌能夠促使虹鱒體內(nèi)免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄合成，感染后第1 d，TNFα1和IL1-β1的轉(zhuǎn)錄顯著提高，于第3、5 d和7 d達(dá)到最高值。據(jù)此可以推斷，本試驗中刺參免疫指標(biāo)的變化亦可能是由于燦爛弧菌促使刺參體內(nèi)免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄合成所致。人工感染燦爛弧菌后第7 d，投喂添加10%CMC飼料的刺參處理組各項非特異性免疫指標(biāo)基本高于其它處理組，因此，以非特異性免疫的改善為評價指標(biāo)時，刺參飼料CMC適宜添加比例為10%。

3.2 蟲草培養(yǎng)基對腸道菌群的影響

刺參腸道中含有約43種細(xì)菌，優(yōu)勢菌群為弧菌屬和假單胞菌屬，其次是桿菌和放線菌等革蘭氏陽性菌。某些弧菌種（Vibrio harveyi，Vibrio alginolyticus，Vibrio splendidus）是海水養(yǎng)殖業(yè)公認(rèn)的重要病原菌，曾引起刺參養(yǎng)殖的巨大損失[2]。孫奕[24]對新鮮刺參及人工條件下饑餓培養(yǎng)的刺參的消化道、體腔液及表皮所分離到的359株細(xì)菌進(jìn)行分離、鑒定，結(jié)果表明其分別屬于弧菌屬、假單胞菌屬等11個主要菌屬，此外，刺參棲居地泥沙中還包含芽孢桿菌屬（Bacillus）和無色桿菌屬（Achromobacter）。腸道菌群易受外界因素，如壓力、抗生素、飼料等的影響。從黃芪、香菇、銀耳、靈芝、人參等植物體中提取的多糖已被作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于動物養(yǎng)殖[25]。多糖進(jìn)入腸道后，同腸道菌群接觸，從而影響腸道菌群的狀態(tài)。張紅梅等[26]研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料甘露寡聚糖水平的升高，生長期鯉魚腸道大腸桿菌數(shù)量隨之減少，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量隨之增加。腸道菌群中包含多種化合物，可以激活動物的免疫反應(yīng)，從腸道菌群獲得的長時間的免疫激活作用可以引發(fā)炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等作用[27]，腸道菌群的穩(wěn)定對抵御腸道病原菌的感染具有重要意義[25]。

本試驗中，人工感染燦爛弧菌后，各處理組刺參腸道TBC有所提高，腸道TBC的升高，可能是由于CMC能夠使刺參腸道內(nèi)某些益生菌的增殖。這與張紅梅等[26]研究結(jié)果一致，多糖代謝產(chǎn)物可以被有益菌利用，從而促進(jìn)腸道有益菌的增殖，抑制有害微生物的生長，實現(xiàn)腸道微生物區(qū)系的優(yōu)化。另一方面，隨著飼料CMC水平的升高，刺參腸道VBC不同程度降低。Zhang等[28]研究同樣表明，低聚果糖能顯著減少刺參腸道中弧菌數(shù)量，增強(qiáng)其抗病能力。多糖免疫增強(qiáng)劑的添加不僅可以有效地促進(jìn)有益菌，如乳酸桿菌[29]與雙歧桿菌[30]的生長，還能影響蛋白質(zhì)消化率[31]和腸道形態(tài)學(xué)[32]。對于哺乳動物而言，弧菌感染的發(fā)病機(jī)制起源于腸道感染，據(jù)此推斷，刺參的發(fā)病也可能是腸道菌群失調(diào)所致[33]，仍需進(jìn)行深入試驗探討驗證。

4 結(jié)論

飼料中添加CMC能改善刺參體腔液非特異性免疫指標(biāo)，增強(qiáng)其對燦爛弧菌的抵抗力，刺參飼料CMC適宜添加水平為10%。