■謝炎福張 爽

（1.洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)系，河南洛陽 471022；2.錦州市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧錦州 121000）

隨著肉禽蛋奶中抗生素等藥物殘留問題的日益顯現(xiàn)，各國畜禽、水產(chǎn)魚類研究人員都在積極探索動物健康養(yǎng)殖的新途徑。中草藥由于安全、天然、有效、無殘留等優(yōu)點日益引起人們的重視，并在動物飼料中廣泛使用；但也存在用藥量大、口感差（發(fā)苦）、使用麻煩、提取成本高等缺點。微生物對中藥進行發(fā)酵是我國中藥炮制領(lǐng)域的一項傳統(tǒng)技術(shù)，中藥經(jīng)發(fā)酵后可以顯著提高藥效、減少藥物用量、改善動物口感，在畜禽方面的應(yīng)用均取得了令人滿意的效果。我國餅粕類資源豐富，其中尤以豆粕、棉粕和菜粕產(chǎn)量最大，是我國畜禽水產(chǎn)飼料的主要植物性蛋白飼料原料來源。由于這些原料中蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量較大，且含有棉酚、硫甙等抗營養(yǎng)成分，限制了他們在飼料中的用量，通過微生物對植物原料進行發(fā)酵處理，可以改善飼料品質(zhì)，降低有害物質(zhì)含量，飼喂益生菌發(fā)酵飼料，可以提高水產(chǎn)動物的生產(chǎn)性能和抗病能力。將益生菌發(fā)酵飼料與微生物發(fā)酵中藥這兩項技術(shù)，通過益生菌這一紐帶結(jié)合起來，共同促進魚類健康養(yǎng)殖是一項很值得探討的研究課題，本次研究旨在探討加入復(fù)合中藥對植物蛋白原料微生物發(fā)酵的影響，并就復(fù)合中藥和植物餅粕混合生物發(fā)酵飼料對草魚魚種生長和非特異性免疫的影響進行了初步研究，為新型生物飼料的開發(fā)研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

米曲霉（Aspergillus oryzae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subitilis）、植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）均為本實驗室內(nèi)保存。

1.1.2 原料

豆粕：粗蛋白含量46%；棉籽餅：粗蛋白含量34.53%、游離棉酚含量775 mg/kg；菜粕：粗蛋白含量36.8%、硫苷含量87.35 μmol/g；麩皮：粗蛋白15.2%，均為市售，粉碎備用。

1.1.3 中草藥

組方為：黃芪18（重量份數(shù)，以下同）、黨參12、當(dāng)歸10、白術(shù)8、茯苓4、柴胡3、陳皮3、山楂4、麥芽6、茵陳4、黃芩6、板藍根4、大黃4、甘草6、生姜3。以上中草藥均購自洛陽藥材市場，在60℃干燥培養(yǎng)箱中烘干2 h，烘干后按照上述配方比例混合，在粉碎機中粉碎，過40目篩，備用。

1.1.4 實驗用魚

實驗用草魚（Ctenopharyngodon idellus）購自吉利良種場，平均體重（31±1）g，用3%食鹽水浸泡消毒15 min，飼養(yǎng)在有增氧過濾裝置的水族箱中。

1.1.5 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基；芽孢桿菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；乳酸菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基；酵母培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)飼料配方：魚粉5%、植物油2%、多維和礦物質(zhì)3%、發(fā)酵基料90%(豆粕20%、菜粕20%、棉粕10%、麥麩15%、次粉15%、玉米10%)。粗蛋白29.87%、粗脂肪4.02%、蛋氨酸0.50%、賴氨酸1.47%。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵基料另加入基料重量1%的硫酸銨即為發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵種子液的制備

酵母菌接種到查氏液體培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，在溫度32℃，轉(zhuǎn)速100 r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)24～32 h，調(diào)整活菌數(shù)達到1×108個/ml，即為枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母種子液。將經(jīng)活化的米曲霉斜面孢子用無菌水沖洗下來，制成孢子濃度為1×107個/ml的孢子懸液，即為米曲霉種子液。植物乳酸菌接種到MRS培養(yǎng)基中，32℃靜置培養(yǎng)12 h。

1.2.2 中藥、植物原料混合發(fā)酵流程和實驗設(shè)計

選擇30個250 ml的三角瓶，每個三角瓶放入50 g 1.1.5中所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照隨機數(shù)字分組的方法分成10組，分別為陰性對照組A，僅有發(fā)酵固體培養(yǎng)基，不加中藥，不進行發(fā)酵；陽性對照組B，僅有發(fā)酵培養(yǎng)基，不加中藥，進行發(fā)酵；另8組分別加入占發(fā)酵培養(yǎng)基0.11%、0.33%、0.55%、0.77%、1.1%、3.3%、5.5%、8.8%的中藥（發(fā)酵培養(yǎng)基按1.1.5所述90%比例加入草魚魚種飼料，分別約相當(dāng)于配合飼料量的0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1%、3%、5%、8%），分別命名為C、D、E、F、G、H、I、J組，每組3個重復(fù)，攪拌混合均勻，調(diào)整至60%含水量，115℃滅菌20 min。自然冷卻后將物料打散，在自然pH值下，總接種量12%，按照米曲霉、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳酸菌1∶2∶1∶1的比例分別將4種菌接種到物料中，在32℃，先好氧發(fā)酵48 h，然后厭氧發(fā)酵48 h，好氧發(fā)酵用紗布封口，厭氧發(fā)酵用塑料布封口，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵飼料在50℃烘箱中烘干，粉碎，備用。

1.2.3 中藥單獨發(fā)酵

按照1.1.3所述中藥組方配制中藥，調(diào)整含水量調(diào)整至65%，在自然pH值下，按照米曲霉、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳酸菌1∶2∶1∶1的比例分別將4種菌接種到物料中，4種菌接種量之和為物料的10%，在發(fā)酵罐中32℃先好氧發(fā)酵48 h，升溫至36℃厭氧發(fā)酵36 h，發(fā)酵結(jié)束后，烘干備用。

1.2.4 草魚飼養(yǎng)與實驗設(shè)計

將購回的草魚幼魚在室內(nèi)玻璃水族箱中暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間投喂基礎(chǔ)飼料，試驗期間水溫24～28℃，每天清除污物，2 d換水一次。待草魚適應(yīng)水族箱環(huán)境后，挑選規(guī)格整齊，無傷病的草魚600尾，按照隨機數(shù)字分組的方法分為5個處理，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)20尾魚。分別投喂以下飼料，K陰性對照組：投喂基礎(chǔ)飼料；L陰性中藥組投喂發(fā)酵飼料（將基礎(chǔ)飼料中發(fā)酵基料部分按照1.2.2中所述方法進行發(fā)酵后，其它成分不變，考慮到發(fā)酵過程中物料的損耗，損耗部分以粉碎的秸稈粉代替，以下同）；M陽性中藥組投喂發(fā)酵飼料+0.3%中藥；N投喂發(fā)酵飼料+0.3%單獨發(fā)酵的中藥；P投喂發(fā)酵飼料+0.3%和發(fā)酵基料混合發(fā)酵的中藥。飼料粒徑1.5 mm，每天投喂3次，每次投喂量為魚體重的3%～4%，實驗共60 d。

1.3 測定及分析方法

采用游離棉酚的測定：參照GB/T 13086—1991；粗蛋白質(zhì)測定：采用凱氏定氮法；硫甙的測定：采用氯化鈀分光光度法；乳酸含量的測定：參照明恒磊的方法進行，略有改動。

脫毒率（%）=100×（原料中含量-發(fā)酵后含量）×原料中含量。

微生物計數(shù)方法：微生物計數(shù)方法采用稀釋平板法。

生長指標的測定：計算增重率、餌料系數(shù)，各指標計算公式：

WGR（%）=(Wt-W0)/W0×100；

FCR=F/(Wt-W0)。

式中：WGR——增重率(%)；

Wt——第t天后各組魚平均體重(g)；

W0——初始時各組魚平均體重(g)；

FCR——餌料系數(shù)；

F——t天內(nèi)各組的飼料攝取量(g)。

血液生化指標的測定：在實驗的第61 d，對各組鯉魚隨機取樣，取樣前停食1 d，采用尾動脈抽血的辦法，每尾魚采血1 ml，取3尾草魚的血液在3 000 r/min的冷凍離心機中離心15 min，參照文獻的辦法，測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LSZ）的活性和丙二醛（MDA）含量，相關(guān)測定試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所科技有限公司。

頭腎體指數(shù)(HKBI)和脾臟體指數(shù)(SBI)的測定：先稱量實驗魚體重，采血后，摘取脾臟和頭腎，用生理鹽水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，在電子天平上稱重。

免疫器官指數(shù)（%）=（免疫器官重量/體重）×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物原料中加入中藥對發(fā)酵結(jié)果的影響(見表1)

隨著固體發(fā)酵培養(yǎng)基中復(fù)方中藥量的增加，總菌數(shù)、棉酚去除率、硫甙去除率、乳酸含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，總菌數(shù)最高的為H組，即培養(yǎng)基中3.3%的中藥添加量總菌數(shù)最高；棉酚去除率最高的為F組，即0.77%的中藥添加量，棉酚去除率最大；硫甙去除率最大為G組，即1.1%的中藥添加量，硫甙去除率最大；乳酸含量最高的為D組，即0.33%的中藥添加量，乳酸含量最高?？偩鷶?shù)中藥添加量0.77%、1.1%、3.3%的F、G、H組顯著高于A、B、C、I、J組（P＜0.05)，其它各組間無顯著差異（P＞0.05)；棉酚去除率B、C、D、E、F、G、H組顯著高于A、I、J組（P＜0.05)，硫甙去除率B、C、D、E、F、G組顯著高于A、I、J組（P＜0.05)，I、J組顯著高于A組（P＜0.05)，其它各組之間無明顯差異（P＞0.05)；乳酸含量A、I、J組顯著低于其它各組（P＜0.05)，考慮到中藥用量，且D組考察的各項指標和最優(yōu)組之間均無顯著差異（P＞0.05)，以固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.33%復(fù)方中藥為宜，即折合草魚飼料中添加0.3%中藥。

表1 中藥對植物原料混菌發(fā)酵的影響

2.2 中藥、植物原料共發(fā)酵對草魚魚種生長的影響（見表2）

表2 中藥和植物原料共發(fā)酵對草魚生長的影響

增重率從大到小依次為P組＞N組＞M組＞L組＞K組，餌料系數(shù)從大到小依次為K組＞L組＞M組＞P組＞N組。增重率N組和P組顯著大于其它各組（P＜0.05），L組和M組顯著大于K組（P＜0.05），其它各組間無顯著差異（P＞0.05）；餌料系數(shù)除N組和P組間無顯著差異（P＞0.05）外，其它各組之間差異顯著（P＜0.05）。

2.3 中藥、植物原料共發(fā)酵對草魚魚種非特異性免疫的影響（見表3）

表3 中藥和植物原料共發(fā)酵對草魚非特異性免疫的影響

LSZ、SOD、頭腎指數(shù)（HKBI）、脾臟指數(shù)從大到小依次為N、P組＞M組＞L組＞K組，丙二醛從大到小依次為K組＞L組＞M組＞P組＞N組。頭腎指數(shù)各組間無顯著差異(P＞0.05)；脾臟指數(shù)N組、P組顯著大于K、L、M組(P＜0.05)，其它各組間無顯著差異（P＞0.05）；丙二醛N組、P組顯著低于K、L、M組(P＜0.05)，M組顯著低于K組（P＜0.05），其它各組間無顯著差異（P＞0.05）；SOD N組、P組顯著大于K、L、M組（P＜0.05），M組顯著大于K組（P＜0.05）；LSZ N組、P組顯著大于K、L組（P＜0.05），L、M組顯著大于K組（P＜0.05）。

2.4 中藥、植物原料共發(fā)酵對草魚魚種肝腎器官的影響（見表4）

表4 中藥和植物原料共發(fā)酵對草魚魚種內(nèi)臟器官的影響

GOT、GPT、Cr、BUN從大到小依次為K組＞L組＞M組＞P、N組。BUN各組間無顯著差異(P＞0.05)；GPT K組顯著高于其它各組(P＜0.05)，N、P組顯著低于L組（P＜0.05），其它各組間無顯著差異（P＞0.05）；GOT N組、P組顯著低于K、L組（P＜0.05）；肌酐K組顯著高于其它各組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 植物蛋白原料中添加中藥對發(fā)酵的影響

豆粕、棉粕、菜粕等植物蛋白原料經(jīng)發(fā)酵后棉酚、硫甙等抗營養(yǎng)因子大幅降低，并產(chǎn)生了乳酸等有益魚類生長的物質(zhì)，說明微生物發(fā)酵是提高植物蛋白原料價值的有效手段。植物蛋白原料加入中藥后，在0.11%～0.77%的濃度范圍內(nèi)，微生物的總數(shù)大幅增加，棉酚和硫甙的去除率以及乳酸含量均得到了不同程度的提高，說明中藥在低濃度時有利于發(fā)酵的進行，這可能和中藥中含有多種氨基酸、微量元素、無機鹽等有益于枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌生長繁殖的成分有關(guān)。隨著發(fā)酵基質(zhì)中中藥量的增加，在添加量大于3%時，微生物的生長受到抑制，棉酚和硫甙的去除率以及乳酸含量亦下降，說明中藥在高濃度時不利于發(fā)酵的進行，這與唐艷紅等的研究結(jié)果類似。多種餅粕類低質(zhì)蛋白原料和中藥混合發(fā)酵，可以簡化生產(chǎn)程序，更利于棉酚、硫甙等抗營養(yǎng)因子的去除以及乳酸等有益成分的增加，與單獨發(fā)酵然后再混合相比較更有優(yōu)勢。值得注意的是，經(jīng)滅菌后，棉酚和硫甙含量均大幅下降，說明高溫滅菌也有利于棉酚和硫甙的降解。

3.2 中藥和植物蛋白原料共同發(fā)酵對草魚魚種生長的影響。

本研究結(jié)果表明，復(fù)合中藥和植物蛋白原料經(jīng)混合菌種發(fā)酵后，增重率較K、L、M 3個對照組分別提高了37.8%、14.3%和11.6%，餌料系數(shù)降低了17.2%、12.7%和9.4%，說明復(fù)合中藥和植物低值餅粕類原料共同發(fā)酵能有效促進草魚魚種的生長和提高飼料報酬。經(jīng)混合菌種發(fā)酵后，雖然發(fā)酵過程中消耗了部分能量物質(zhì)，但產(chǎn)生了一定量的菌體蛋白以及大量維生素、乳酸等微生物代謝產(chǎn)物，植物原料及中藥中大分子的蛋白質(zhì)、淀粉等分解成小肽、氨基酸、葡萄糖等小分子物質(zhì)，組成植物細胞壁的纖維素、半纖維素等轉(zhuǎn)化為可被草魚利用的成分。中藥中含有黃酮、苷類等活性物質(zhì)，這些成分具有促進食欲，增強機體代謝活動，促進消化酶分泌等作用，加速水產(chǎn)動物的生長發(fā)育，經(jīng)發(fā)酵后，這些物質(zhì)更易被魚類利用。中藥和植物蛋白原料共同發(fā)酵和中藥、植物蛋白原料分別發(fā)酵的實驗組沒有顯著差異，而從生產(chǎn)工藝上來說，明顯的混合發(fā)酵優(yōu)于單獨發(fā)酵。

3.3 中藥和植物蛋白原料共同發(fā)酵對草魚魚種非特異性免疫的影響

SOD在活性氧自由基清除、防止細胞損傷方面有重要作用；丙二醛反映細胞膜脂質(zhì)過氧化的程度。中藥和植物蛋白原料共同發(fā)酵后，草魚SOD的升高伴隨著丙二醛含量的下降，說明飼喂混合發(fā)酵飼料有助于草魚魚種抗氧化能力的提高。本研究結(jié)果表明，血清溶菌酶能夠抵抗病原侵入，增強魚類抗病能力，飼喂添加0.3%中藥的發(fā)酵飼料后顯著提高了草魚魚種血清溶菌酶含量，反映魚類抗病能力增強，這對保護魚體健康，提高免疫力具有一定的積極意義。脾臟和頭腎為魚類的免疫器官，脾臟指數(shù)和頭腎指數(shù)的增大，反映植物原料中添加中藥共同發(fā)酵對草魚魚種免疫器官的發(fā)育具有促進作用，豆粕、菜籽粕和棉粕中含有胰蛋白酶抑制因子、棉酚、硫甙等毒性物質(zhì)，能引起魚類機體代謝紊亂，肝、腎腫大，出現(xiàn)肝出血和壞死等癥狀。經(jīng)微生物發(fā)酵后，這些毒性物質(zhì)得到分解、去除，配方中草藥中含有大量的有機酸、生物堿、免疫多糖和黃酮等活性物質(zhì)，能夠有效調(diào)整機體的機能紊亂和增強機體對有害刺激的抵抗力，促進溶菌酶含量的提高和頭腎、脾臟等免疫器官的發(fā)育。

3.4 中藥和植物蛋白原料共同發(fā)酵對草魚魚種肝、腎內(nèi)臟器官的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要由魚類肝臟合成，正常情況下血液中含量穩(wěn)定，它的升高往往反映了肝臟器官的損傷，肌酐和尿素氮由腎臟排出體外，含量高低反映了腎臟器官的功能狀況。中藥和植物原料經(jīng)發(fā)酵后，GOT、GPT、Cr、BUN含量均有所下降，發(fā)酵過程中，植物原料中多種毒性物質(zhì)被微生物降解，降低了對草魚肝臟、腎臟、脾等內(nèi)臟器官的刺激作用，這和發(fā)酵過程中棉酚、硫甙等有害物質(zhì)的下降是一致的。復(fù)方中藥中含有的茵陳、白術(shù)等藥物有助于肝臟器官的損傷修復(fù)，中藥經(jīng)多菌種發(fā)酵后，由于物理“破壁效應(yīng)”，有利于植物細胞中各種活性成分和營養(yǎng)成分的溶出，發(fā)酵方法條件溫和，避免了傳統(tǒng)蒸煮、有機溶劑提取的高溫等極端環(huán)境，使復(fù)合中藥中的部分活性成分得以保留，促進了魚類的生長，使抗病能力得以提高，且中藥、微生物相互作用，有可能產(chǎn)生了新的有助于保護魚類健康的生物活性成分。

3.5 多種方式，多靶點的共同作用

植物蛋白原料和中藥經(jīng)發(fā)酵后，利用率得以提高，微生物利用植物原料和中藥為基質(zhì)得以繁殖，中藥中部分成分促進微生物生長，生長過程中產(chǎn)生多種維生素和未知促生長因子，且混合菌種中的枯草芽孢桿菌、乳酸菌可以在魚類腸道中定植，發(fā)揮生物奪氧，改善腸道環(huán)境等作用，抑制有害微生物的繁殖，互相促進，共同提高了魚類的生長和抗病能力。

4 總結(jié)

中藥在0.11%～0.77%的添加量時，有利于植物原料發(fā)酵過程中棉酚、硫甙的降解和乳酸含量的提高，在添加量大于3%時，不利于植物原料的微生物發(fā)酵；植物蛋白原料中添加0.3%的復(fù)方中藥共同發(fā)酵后，相比較對照組，增重率提高了37.8%，餌料系數(shù)降低了17.2%，顯著提高了草魚魚種的非特異性免疫能力，對草魚內(nèi)臟器官具有一定保護作用；中藥和植物原料單獨發(fā)酵和混合發(fā)酵均對草魚魚種的生長和非特異性免疫能力的提高具有促進作用，但兩者之間沒有顯著差異。

（參考文獻18篇，刊略，需者可函索）