■李小梅 楊麗冬 張家學 舒 琥 張海發(fā)

(1.廣州大學生命科學學院，廣東廣州510006；2.廣東海大集團股份有限公司研究院，廣東廣州511400；3.廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗中心，廣東惠州516081)

近年來，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）已成為我國廣東、福建和海南等地重要的養(yǎng)殖品種之一。在斜帶石斑魚人工養(yǎng)殖過程中，細菌、病毒或寄生蟲等引起的病害防治和管理工作十分迫切，尤其對于養(yǎng)殖密度較大或者養(yǎng)殖高度集中、更容易造成病害發(fā)生和流行的網(wǎng)箱養(yǎng)殖場，漁民們不得不依賴抗生素來進行石斑魚病害防治，而抗生素的濫用導致了嚴重的食品安全問題。因此，要從根本上解決石斑魚等經(jīng)濟魚類的病害、食品安全問題，需要開發(fā)使用優(yōu)質(zhì)餌料、合理選用免疫制品、結(jié)合科學防病等措施來提高養(yǎng)殖魚類機體的抗病力；因此，預防為主，進行石斑魚的生態(tài)健康養(yǎng)殖非常必要[1-3]。

本研究擬開發(fā)一種復合益生菌飼料添加劑，探討其對斜帶石斑魚生長及非特異性免疫特性相關(guān)指標的影響，為石斑魚病害防治的益生菌制劑開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及分組

1.1.1 實驗材料

實驗用斜帶石斑魚由廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗中心提供；實驗飼料包括基礎(chǔ)飼料（系市售東丸牌石斑魚配合飼料）、乳化魚油包裹飼料（由2%飼料量的乳化魚油包裹基礎(chǔ)飼料）和復合菌飼料（復合菌飼料由基礎(chǔ)飼料與不同用量的復合益生菌混勻，再以2%飼料用量的乳化魚油包裹制得）。實驗用復合益生菌為：20%光合細菌（Rhodop seudanonas palustris）菌液、2%短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）菌粉和78%嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）菌液混合組成（按照質(zhì)量百分比），每10 g復合菌含2.0 ml光合細菌菌液、0.2 g短小芽孢桿菌菌粉和7.8 ml嗜酸乳桿菌菌液。實際操作是，先將短小芽孢桿菌菌粉混合到嗜酸乳桿菌菌液中，再將其與光合細菌菌液混合均勻制得。

實驗用益生菌由廣東海大集團股份有限公司研究院提供；其中，光合細菌、嗜酸乳桿菌和短小芽孢桿菌的有效活菌數(shù)分別為1.0×109、1.0×109cfu/g和2.0×109cfu/g。

1.1.2 實驗分組及石斑魚養(yǎng)殖管理

實驗用斜帶石斑魚初始體質(zhì)量為(64.69±8.65)g，隨機分為對照組、乳化魚油組和復合菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組共5組，每組設(shè)3個平行，每個平行10尾魚，共150尾魚；對照組投喂基礎(chǔ)飼料，乳化魚油組投喂乳化魚油包裹飼料，復合益生菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別投喂對應(yīng)的復合菌飼料，其中復合菌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組飼料分別由每千克基礎(chǔ)飼料添加10、30 g和50 g復合菌混合均勻制得。

每日定時定量投喂，投喂率為體重的2%。各復合益生菌飼料組的飼料準備在飼喂前30 min完成；飼喂實驗共30 d。

養(yǎng)殖池水體采用沙濾海水，池內(nèi)為對流式進出水；實驗期間保持養(yǎng)殖池的連續(xù)充氣狀態(tài)，于廣東大亞灣水產(chǎn)試驗中心的水泥池網(wǎng)箱中進行養(yǎng)殖。

1.2 指標及測定方法

1.2.1 生長性能指標測定

對飼喂30 d的實驗斜帶石斑魚進行稱重和測量體長。

體增重率(%)=[(試驗末體重-試驗初體重)/試驗初體重]×100；

體增長率(%)=[(試驗末體長-試驗初體長)/試驗初體長]×100；

飼料系數(shù)=投喂量/(試驗末體重-試驗初體重)；

肥滿度（g/cm3）=100×（體重/體長3）。

1.2.2 血清中免疫相關(guān)酶活性的測定

于飼喂石斑魚的第30 d進行血清取樣，取樣前1 d停止投喂飼料；每組取20尾魚，采用穿刺尾動脈法取血，采集的血樣置于4℃冰箱靜置4 h，然后以10 000 r/min離心10 min，收集上層血清測定酶活。血清總超氧化物歧化酶（SOD）、血清總抗氧化酶（TAOC）、血清酸性磷酸酶（ACP）、血清堿性磷酸酶（AKP）和溶菌酶活力測定均按相應(yīng)試劑盒方法進行（試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號均為20130918）。

1.2.3 攻毒實驗

對石斑魚進行稱重和體長測量結(jié)束后，用哈維氏弧菌活菌菌懸液（1×108cfu/ml）通過腹腔注射進行攻毒，實驗組石斑魚各10尾，0.2 ml/尾，然后置于干凈的水族缸內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)并觀察10 d，飼養(yǎng)條件和注射前相同，每天多次觀察和記錄石斑魚的發(fā)病和死亡情況，對死亡的石斑魚進行解剖、細菌分離并確認死因。按照以下公式計算：

免疫保護率(%)=[1-（免疫組死亡率/對照組死亡率）]×100。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

測定結(jié)果用“平均值±標準差（X±SD）”表示，統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件包進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合益生菌對石斑魚生長性能的影響(見表1)

由表1可知，與對照組相比，乳化魚油組的斜帶石斑魚體增重率、體增長率、肥滿度和飼料系數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）；與對照組和乳化魚油組相比，復合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組石斑魚的體增重率與體增長率均顯著提高（P＜0.05），肥滿度均顯著提升（P＜0.05），飼料系數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。由此說明，斜帶石斑魚生長特性顯著性差異來源于復合益生菌的作用，也就是說，基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量的復合益生菌制得的飼料均可以有效改善石斑魚的生長特性，并提高飼料利用率。值得提出的是，不同復合益生菌用量的Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組間石斑魚的體增重率、體增長率、肥滿度、飼料系數(shù)等差異性均不顯著（P＞0.05）。

表1 復合益生菌對斜帶石斑魚的促生長作用（X±SD，n=20）

2.2 復合益生菌對石斑魚血清中免疫相關(guān)酶活性的影響(見表2)

由表2可知，與對照組相比，乳化魚油組石斑魚血清AKP、ACP、總SOD、T-AOC和溶菌酶活力與對照組無顯著差異(P＞0.05)；而復合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組石斑魚的血清AKP、ACP活力均顯著升高(P＜0.05)，總SOD、TAOC、溶菌酶活力呈極顯著性升高(P＜0.01)；復合益生菌Ⅲ組的ACP活力呈顯著性升高(P＜0.05)，AKP、總SOD、T-AOC、溶菌酶活力呈極顯著性升高(P＜0.01)。但與乳化魚油組相比，復合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組斜帶石斑魚的血清AKP、ACP、T-AOC、溶菌酶活力均顯著升高(P＜0.05)，總SOD活力呈極顯著性升高(P＜0.01)。

表2 復合益生菌對斜帶石斑魚免疫相關(guān)酶活性的影響（X±SD，n=20，U/ml）

由此說明，添加益生菌可有效提高斜帶石斑魚部分非特異免疫特性的作用，包括增加血清AKP、ACP、T-AOC和溶菌酶活力和增加血清總SOD活力。復合菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間石斑魚AKP、ACP、總SOD、T-AOC和溶菌酶活力均無顯著性差異（P＞0.05）。這說明，基礎(chǔ)飼料中添加3種不同劑量的復合益生菌均可增強石斑魚的非特異性免疫功能，但不同用量組間差異不顯著。

2.3 復合益生菌對攻毒后石斑魚成活的影響（見表3）

表3 復合益生菌對斜帶石斑魚攻毒后的影響（n=10，%）

如表3所示，復合益生菌飼料投喂攻毒后斜帶石斑魚，在復合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別較對照組存活率高30.0～40.0個百分點，較乳化魚油組存活率提高20.0～30.0個百分點；復合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別較乳化魚油組的免疫保護率提高40.0個百分點以上，最高達到60.0個百分點。

由此可見，基礎(chǔ)飼料中添加復合益生菌可明顯提高對攻毒石斑魚的免疫保護作用，從而提高了攻毒石斑魚的存活率。

3 討論

本研究中，以復合益生菌飼料飼喂斜帶石斑魚30 d，均表現(xiàn)出明顯促進了石斑魚的生長和飼料利用率的提升。就組成復合益生菌的菌種而言，光合細菌、短小芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌均屬水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌，已分別有促進魚類生長的文獻報道[4-7]，但未見將這3種菌一起復配的相關(guān)研究。與相關(guān)文獻報道不同的是，本實驗用乳化魚油將復合益生菌包裹于飼料表面，避免了投喂時菌體快速分散于水中而流失，從而保證了復合菌與飼料顆粒一起能被實驗魚充分有效攝食；乳化魚油組斜帶石斑魚的各項指標較對照組均未構(gòu)成統(tǒng)計學上的差異性，由此提示，乳化魚油包裹可作為益生菌拌料的可行方式。

魚類在抵抗病害感染時，機體的非特異性免疫會發(fā)揮十分重要作用，免疫相關(guān)酶的活性會被激活[8-9]。在魚類等低等脊椎動物及軟體動物中，SOD是機體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，AKP作為重要的代謝調(diào)控酶，ACP作為溶酶體酶的重要組成部分，它們保證了溶酶體有效完成防御和消化的雙重功能，T-AOC在抗氧化調(diào)節(jié)方面起重要作用,溶菌酶則是魚類非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。若魚體內(nèi)上述幾種酶活力提升，則機體抗病力顯著增強。

本研究表明，飼喂復合益生菌后石斑魚血清中有5種免疫相關(guān)酶的活性均顯著升高，可見魚體免疫功能從多途徑方面得以增強，從而保證其健康生長。該復合益生菌體現(xiàn)出的增強免疫功效可能與菌種的選擇、菌種量或菌種復配方法等有關(guān)。復合菌中的光合細菌菌液中富含自身代謝產(chǎn)生的免疫多糖及輔酶Q10，具有良好免疫刺激活性及抗氧化活性[10]；短小芽孢桿菌能產(chǎn)生高抑制弧菌活性的細菌素，對水產(chǎn)上常見主要致病菌有良好的拮抗效果[5]；嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸能力和分泌乳酸菌素的能力強，可黏附于魚腸道表皮細胞，酸化腸道，刺激腸道免疫和抑制病原菌[7]。這三種菌復配時，光合細菌菌液偏堿性且含有高含量的黏多糖，嗜酸乳桿菌菌液呈酸性，而短小芽孢桿菌具有一定的緩沖能力和酸中和能力，因此，先將嗜酸乳桿菌與短小芽孢桿菌混合，有助于減少pH值的瞬間變化對嗜酸乳桿菌和光合細菌的影響，同時利于增加混合均勻度。

本實驗構(gòu)建的復合益生菌不僅綜合了各組成菌的優(yōu)良特性，同時促進了不同菌之間的互作，如光合細菌的代謝產(chǎn)物能促進嗜酸乳桿菌和短小芽孢桿菌的繁殖，短小芽孢桿菌在石斑魚體內(nèi)快速繁殖降低腸道氧化還原電位，為嗜酸乳桿菌的增殖創(chuàng)造良好的厭氧環(huán)境。

斜帶石斑魚以哈維氏弧菌攻毒實驗結(jié)果表明，飼喂復合益生菌的魚死亡出現(xiàn)時間延后，且死亡率明顯低于對照組，這進一步體現(xiàn)了復合益生菌具備良好的增強免疫效果。

最后，三種不同劑量的復合益生菌飼喂斜帶石斑魚后，組間的生長性能指標與免疫特性指標均無統(tǒng)計學意義上的差別，即未呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)，這可能與實驗中選擇的劑量水平有關(guān)，實驗中各菌種的菌數(shù)水平較高，分別達到109cfu/g。若基于性價比最優(yōu)或安全性劑量水平考慮，最適復合益生菌添加水平需要進一步進行研究。