■馬歌麗 杜聰聰 張 威 索軍陽

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002）

類胡蘿卜素是一類普遍存在于動(dòng)物、高等植物、真菌和藻類中的黃色、橙紅色或紅色的色素[1-3]。β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素的典型代表，被廣泛用作食品著色劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑和化妝品著色劑[4-5]。醫(yī)學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素在提高機(jī)體免疫活性、防治癌癥和心血管病等方面頗具生理活性功能[6-9]。

β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、植物提取法和微生物發(fā)酵法三種?；瘜W(xué)合成的食用色素因毒性問題使其在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制；而從植物中提取天然色素存在成本高、價(jià)格貴和工藝復(fù)雜等不足[10-11]；微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素因成本低和不受環(huán)境條件限制越來越受到重視[12-13]。產(chǎn)β-胡蘿卜素的微生物主要有三孢布拉霉菌和紅酵母[14]。雖然紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的水平?jīng)]有三孢布拉霉菌的高，但紅酵母屬于我國飼料行業(yè)12種確認(rèn)的飼用微生物之一，具有生長周期短、營養(yǎng)要求簡單和菌體可綜合利用等特點(diǎn)，因此，利用紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[15-16]。目前，紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素面臨的最大問題是β-胡蘿卜素的產(chǎn)量偏低，尚未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平[17-19]。提高紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的途徑主要有通過生物技術(shù)手段篩選高產(chǎn)菌株、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方和優(yōu)化發(fā)酵條件等[20]。本研究主要對(duì)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，以期提高紅酵母搖床發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

紅酵母由鄭州輕工業(yè)學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室篩選菌種。

1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/l、蛋白胨20 g/l、酵母粉10 g/l、瓊脂20 g/l，pH值自然。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/l、蛋白胨10 g/l、酵母粉10 g/l，pH值自然。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/l、蛋白胨10 g/l、酵母粉10 g/l，調(diào)pH值6.0。

所有培養(yǎng)基均于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min。

1.3 紅酵母的培養(yǎng)

菌種活化：挑取紅酵母菌種轉(zhuǎn)接至活化培養(yǎng)基斜面，于28℃恒溫培養(yǎng)48 h。

種子培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取活化斜面培養(yǎng)基上長勢較好的紅酵母至裝液量為50 ml/250 ml三角瓶種子培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

揺瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液以5%的接種量接到裝液量為100 ml/250 ml三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)70 h。

1.4 生物量的測定

將發(fā)酵液3 000 r/min離心15 min，棄上清液，菌體沉淀用蒸餾水洗滌兩次，收集菌體，于烘箱中60℃烘干至恒重，稱量得紅酵母生物量，記為M(g/l)。

1.5 β-胡蘿卜素的提取和測定

1.5.1 β-胡蘿卜素的提取

準(zhǔn)確稱取0.1 g烘干的紅酵母菌體于5 ml 3 mol/l的鹽酸中，室溫振蕩1 h，沸水煮6 min，迅速冷卻，3 000 r/min離心15 min棄上清液，沉淀用蒸餾水洗滌2次，溶于5 ml丙酮中，于室溫振蕩30 min，10 000 r/min離心10 min，上清液即為β-胡蘿卜素提取液。將β-胡蘿卜素提取液適當(dāng)稀釋，用UV-2600型分光光度計(jì)在475 nm處測定吸光度。

1.5.2 β-胡蘿卜素含量的測定

①β-胡蘿卜素含量的計(jì)算：

式中：C——β-胡蘿卜素含量(μg/g干菌體)；

Aλmax——475 nm處胡蘿卜素的吸光度；

D——試樣的稀釋倍數(shù)；

V——提取用丙酮體積(ml)；

0.16——胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)；

W——紅酵母干菌體質(zhì)量(g)。

②β-胡蘿卜素產(chǎn)量的計(jì)算：

Y=M×C。

式中：Y——β-胡蘿卜素產(chǎn)量(mg/l)；

M——紅酵母生物量(g/l)；

C——β-胡蘿卜素含量(μg/g干菌體)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅酵母生長曲線的測定

將振蕩培養(yǎng)24 h的種子培養(yǎng)液，以5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min培養(yǎng)。每隔4 h取10 ml培養(yǎng)液，測定紅酵母生物量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，生物量為縱坐標(biāo)繪制紅酵母生長曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 紅酵母生長曲線

由圖1可知，紅酵母的延滯期為0～12 h，指數(shù)期為12～28 h，穩(wěn)定期為28～72 h，72 h之后紅酵母進(jìn)入衰亡期。在指數(shù)期，細(xì)胞以幾何級(jí)數(shù)增長，生長速率常數(shù)最大，細(xì)胞平衡生長，代謝旺盛，以指數(shù)期的種子接種，可以大大降低培養(yǎng)物的延滯期，因此選擇24 h為種齡。

2.2 紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵曲線的測定

將振蕩培養(yǎng)24 h的種子培養(yǎng)液，以5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min培養(yǎng)。每隔4 h取10 ml發(fā)酵培養(yǎng)液，離心棄上清液，菌體沉淀反復(fù)用蒸餾水洗滌后烘干，參照1.5方法進(jìn)行β-胡蘿卜素的提取和測定。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量為縱坐標(biāo)，繪制紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的發(fā)酵曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵曲線

從圖2可以看出，在菌體生長0～30 h之間，紅酵母不產(chǎn)β-胡蘿卜素；30 h之后，β-胡蘿卜素逐漸形成；30～68 h之間，β-胡蘿卜素的量呈上升趨勢，直至68 h β-胡蘿卜素的積累量達(dá)到最大。68～72 h之間，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量趨于平穩(wěn)，72 h后β-胡蘿卜素的產(chǎn)量逐漸降低。根據(jù)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素積累量在菌體生長的穩(wěn)定期達(dá)到最大推斷，β-胡蘿卜素屬于紅酵母的次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，紅酵母菌體的收集及色素的提取選擇在70 h進(jìn)行。

2.3 紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

2.3.1 碳源對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

分別選取40 g/l的蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖和可溶性淀粉代替葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一碳源，其余培養(yǎng)基成分不變，發(fā)酵培養(yǎng)基接種紅酵母后于28℃、180 r/min培養(yǎng)70 h，收集菌體并測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。碳源種類對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響如圖3所示。

圖3 碳源種類對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一，它既供給酵母細(xì)胞生命活動(dòng)所需要的能量，又是類胡蘿卜素碳架的來源，因此，適宜的碳源可以促進(jìn)菌體的生長和β-胡蘿卜素的生成。由圖3可以看出，碳源種類對(duì)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響較大。以葡萄糖為唯一碳源時(shí)β-胡蘿卜素的產(chǎn)量最高，蔗糖次之，可溶性淀粉最低。從工業(yè)利用角度考慮，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中的葡萄糖可通過水解淀粉得到。綜合考慮，選取葡萄糖作為紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的最佳碳源。

2.3.2 葡萄糖濃度對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

以葡萄糖為碳源，葡萄糖濃度分別為10、20、30、40、50 g/l和60 g/l，其余培養(yǎng)基成分不變，將發(fā)酵培養(yǎng)基接種后于28℃、180 r/min培養(yǎng)70 h，收集菌體并測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。葡萄糖濃度對(duì)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響如圖4所示。

由圖4可見，當(dāng)葡萄糖濃度在10～40 g/l時(shí)，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量呈遞增趨勢；當(dāng)葡萄糖濃度為40～50 g/l時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最大值；當(dāng)葡萄糖濃度高于50 g/l時(shí)，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量緩慢下降。由此可知，葡萄糖濃度對(duì)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素有較大影響，葡萄糖濃度過高或過低都不利于β-胡蘿卜素的生成。當(dāng)葡萄糖濃度低于40 g/l時(shí)，培養(yǎng)基中所含碳源不能滿足紅酵母生長和β-胡蘿卜素合成的需要，導(dǎo)致菌體生長緩慢，產(chǎn)物積累較少；當(dāng)葡萄糖濃度高于50 g/l時(shí)，可能引起培養(yǎng)液的黏度增加，溶氧量降低，也可能導(dǎo)致酵母細(xì)胞質(zhì)壁分離，進(jìn)而β-胡蘿卜素產(chǎn)量降低。因此，葡萄糖濃度初步確定為40 g/l。

圖4 葡萄糖濃度對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

2.3.3 氮源種類對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

以40 g/l葡萄糖為碳源，分別選取20 g/l的蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨以及10 g/l蛋白胨與10 g/l酵母粉復(fù)合物為氮源，在其余培養(yǎng)基成分不變的條件下，將發(fā)酵培養(yǎng)基接種后于28℃、180 r/min培養(yǎng)70 h，收集菌體并測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。氮源種類對(duì)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響如圖5所示。

圖5 氮源種類對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

由圖5可見，以酵母粉為氮源時(shí)最有利于酵母生成β-胡蘿卜素，蛋白胨和酵母粉構(gòu)成的復(fù)合氮源次之，再者為牛肉膏、蛋白胨，無機(jī)氮源硫酸銨作為氮源不利于β-胡蘿卜素的生產(chǎn)。因此確定酵母粉為最佳氮源。

2.3.4 酵母粉添加量對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

以40 g/l葡萄糖為碳源，酵母粉為氮源，酵母粉添加量分別為5.0、10.0、15.0、20.0 g/l和25.0 g/l，在其余培養(yǎng)基成分不變的條件下，將發(fā)酵培養(yǎng)基接種后于28℃、180 r/min培養(yǎng)70 h，收集菌體并測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。酵母粉添加量對(duì)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響如圖6所示。

圖6 酵母粉添加量對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

由圖6可知，當(dāng)酵母粉添加量在5～20 g/l時(shí)，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量呈遞增趨勢，當(dāng)酵母粉添加量高于20 g/l時(shí)，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量呈下降趨勢。與葡萄糖濃度對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響類似，酵母粉添加量過高或過低也不利于菌體的生長和代謝產(chǎn)物的積累。因此，酵母粉添加量初步確定為20 g/l。

2.3.5 無機(jī)鹽對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

以40 g/l葡萄糖為碳源，20 g/l酵母粉為氮源，分別添加 0.5 g/l的 CuSO4、MgSO4、FeSO4、K2HPO4、NaCl和CaCl2，在其余培養(yǎng)基成分不變的條件下，將發(fā)酵培養(yǎng)基接種后于28℃、180 r/min培養(yǎng)70 h，收集菌體并測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。無機(jī)鹽對(duì)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響如圖7所示。

圖7 無機(jī)鹽對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

無機(jī)鹽在構(gòu)成細(xì)胞分子、調(diào)節(jié)滲透壓及胞內(nèi)pH值等方面具有重要的功能。由圖7可知，與對(duì)照組相比，添加適量的MgSO4能促進(jìn)β-胡蘿卜素的積累。K2HPO4和NaCl對(duì)β-胡蘿卜素的積累影響不大，而Cu-SO4、FeSO4和CaCl2均對(duì)β-胡蘿卜素的生產(chǎn)有抑制作用。因此，選擇0.5 g/l MgSO4作為紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽。

2.3.6 維生素對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

以40 g/l葡萄糖為碳源、20 g/l酵母粉為氮源，考察不同濃度的VB1、VB2對(duì)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 維生素對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

生長因子是一類調(diào)節(jié)微生物正常代謝所必需的有機(jī)物，狹義的生長因子一般僅指維生素。由圖8可以看出，VB1和VB2對(duì)β-胡蘿卜素的產(chǎn)量均有影響。從胡蘿卜素產(chǎn)量提高程度方面分析，VB2對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的提高更大。同時(shí)，由圖8也可以看出，維生素添加過多或過少均起不到提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量的作用。因此，確定VB1和VB2的最佳添加量分別為0.5 mg/l和1.5 mg/l。

2.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

以40 g/l葡萄糖為碳源、20 g/l酵母粉為氮源，添加 0.5 g/l MgSO4、0.5 mg/l VB1和 1.5 mg/l VB2，分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)β-胡蘿卜素的影響如圖9所示。

圖9 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

由圖9可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素有較大影響。在偏酸性的環(huán)境中，紅酵母發(fā)酵β-胡蘿卜素的產(chǎn)量較高。另外，從工業(yè)生產(chǎn)的角度考慮，偏酸性的環(huán)境可以抑制雜菌的生長，這對(duì)色素的大規(guī)模生產(chǎn)極為有利。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值初步確定為6.0。

2.3.8 裝液量對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

以40 g/l葡萄糖為碳源、20 g/l酵母粉為氮源，添加 0.5 g/l MgSO4、0.5 mg/l VB1和 1.5 mg/l VB2，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.0，在250 ml三角瓶中分別裝入40、60、80、100、120 ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后于28℃、180 r/min培養(yǎng)70 h，收集菌體并測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。裝液量對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響如圖10所示。

由圖10可知，裝液量為60 ml/250 ml時(shí)紅酵母發(fā)酵β-胡蘿卜素產(chǎn)量較高。隨著裝液量的增加，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量逐漸下降。裝液量主要影響發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量，隨著裝液量的增加，單位體積發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量降低，菌體生長緩慢，進(jìn)而導(dǎo)致β-胡蘿卜素產(chǎn)量的下降。在工業(yè)生產(chǎn)中，除了控制裝液量外，也可以采用提高發(fā)酵罐攪拌速度或者補(bǔ)充氧氣的方法來控制培養(yǎng)基中的溶氧量從而提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量確定為60 ml/250 ml。

圖10 裝液量對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)紅酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素影響較大的四個(gè)因素即葡萄糖濃度(A)、酵母粉添加量(B)、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值(C)、裝液量(D)，每個(gè)因素選取三個(gè)水平，按L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)，以不接種的培養(yǎng)液為對(duì)照，以β-胡蘿卜素產(chǎn)量為指標(biāo)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平如表1所示，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析如表2所示。

表1 因素水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

從表2的極差分析結(jié)果可見，各因素對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量影響的主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即葡萄糖濃度是影響紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的主要因素，其次為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值、裝液量和酵母粉添加量。通過表2的結(jié)果可以看出，β-胡蘿卜素的最高產(chǎn)量為3.815 mg/l，對(duì)應(yīng)的因素水平組合為A2B3C1D2。從表2的較優(yōu)水平分析可知，紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的最佳組合為A2B3C2D2，即葡萄糖濃度為40 g/l、酵母粉添加量為25 g/l、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值6.0、裝液量為60 ml/250 ml，為驗(yàn)證此條件下的β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)分析得到的最佳條件組合A2B3C2D2，即葡萄糖 40 g/l，酵母粉 25 g/l、0.5 g/l Mg-SO4、0.5 mg/l VB1、1.5 mg/l VB2、發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH值 6.0、裝液量60 ml/250 ml，于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)70 h，收集菌體并測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量，以驗(yàn)證正交試驗(yàn)的分析結(jié)果，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，在最佳條件下，紅酵母發(fā)酵β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到3.865 mg/l，該結(jié)果不僅高于表2中的最高值3.815 mg/l，而且與優(yōu)化前β-胡蘿卜素的產(chǎn)量2.368 mg/l（見圖2）相比，提高了63.2%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到紅酵母發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖40 g/l、酵母粉 25 g/l、MgSO40.5 g/l、VB10.5 mg/l、VB21.5 mg/l、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值6.0、裝液量60 ml/250 ml。運(yùn)用該優(yōu)化培養(yǎng)基配方將紅酵母于28℃、180 r/min培養(yǎng)70 h，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到3.865 mg/l，與優(yōu)化前β-胡蘿卜素產(chǎn)量2.368 mg/l相比，提高了63.2%。