鄔國斌何劍波綜述連芳審校

作者單位：530021南寧廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科

綜述

CLARITY技術(shù)及其在生物學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

鄔國斌何劍波綜述連芳審校

作者單位：530021南寧廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科

CLARITY技術(shù)是近年出現(xiàn)的使器官組織透明化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對完整器官組織實(shí)現(xiàn)透明化后，應(yīng)用免疫組化染色，在激光掃描共聚焦顯微鏡掃描下實(shí)現(xiàn)研究對象的三維成像，目前已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。本文就CLARITY技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀及其展望作一總結(jié)。

生物技術(shù)；CLARITY技術(shù)；透明化；激光掃描共聚焦顯微鏡；三維成像

CLARITY技術(shù)是采用一種透明水凝膠替代器官組織中的脂類，固定細(xì)胞組分中的蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、DNA、RNA等物質(zhì)，讓器官組織變?yōu)橥该髑腋诖蠓肿訚B透的全新實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在此基礎(chǔ)上對完整器官組織進(jìn)行化學(xué)、遺傳學(xué)和光學(xué)分析，最后在細(xì)胞/分子水平上對結(jié)構(gòu)完整的器官組織進(jìn)行高分辨率三維成像［1］。該項(xiàng)新技術(shù)將生物學(xué)研究帶入完整器官成像的全新領(lǐng)域，從根本上改變對器官組織的理解，是生物學(xué)研究領(lǐng)域跨時(shí)代的一個(gè)技術(shù)革新。為更好地理解和掌握該技術(shù)，以下就CLARITY技術(shù)特點(diǎn)及其在生物研究中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 CLARITY技術(shù)的背景

三維空間重建在闡明生物體組織結(jié)構(gòu)與生理功能之間以及毗鄰組織之間的關(guān)系，在形態(tài)學(xué)、比較解剖學(xué)、細(xì)胞化學(xué)定位等領(lǐng)域研究中的重要意義已得到業(yè)內(nèi)學(xué)者廣泛認(rèn)可。自90年代后，生物學(xué)領(lǐng)域中真實(shí)再現(xiàn)器官組織的三維圖像主要應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像三維重建技術(shù)，其中最為常用的是連續(xù)組織切片的計(jì)算機(jī)三維重建技術(shù)，即對某一細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)薄切片，然后把這一系列切片的圖像，通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理，從而得到該結(jié)構(gòu)的立體形態(tài)的一種方法［2～4］。在隨后研究中，計(jì)算機(jī)圖像三維重建技術(shù)在生物器官組織病理生理、腫瘤發(fā)生和發(fā)展等領(lǐng)域應(yīng)用取得了巨大的研究成果，但也發(fā)現(xiàn)計(jì)算機(jī)圖像重建技術(shù)步驟繁雜，受干擾因素影響很大，如計(jì)算機(jī)硬件設(shè)備、三維重建的理論計(jì)算法與顯示方式的系統(tǒng)環(huán)境及圖像的定位、壓縮、自動分割相關(guān)的圖像處理，極易造成三維重建結(jié)果和參數(shù)計(jì)算的數(shù)據(jù)偏差，甚至不能真實(shí)反映組織三維空間結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重限制了相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)研究［5～10］。多年來，研究人員一直致力于生物組織連續(xù)切片的三維重建和三維顯示工作的應(yīng)用及優(yōu)化，以求進(jìn)一步完善二維切片圖像的三維重建理論及進(jìn)一步提高重建速度，改善圖像顯示效果，以擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域，然而未能在技術(shù)上實(shí)現(xiàn)突破。

2 CLARITY技術(shù)的特點(diǎn)

2013年Chung等［1］在《Nature》科學(xué)雜志首次介紹了CLARITY技術(shù)，其核心就是應(yīng)用水凝膠來替代細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，水凝膠骨架可以很好地與組織細(xì)胞組分，包括蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、DNA、RNA等生物信息物質(zhì)結(jié)合。將細(xì)胞結(jié)構(gòu)鎖定之后，在電泳條件下用去垢劑洗（SDS）緩慢去除細(xì)胞上影響大分子物質(zhì)滲透和光線透過的脂質(zhì)成分，使研究對象成為保持完整組織結(jié)構(gòu)的透明標(biāo)本。由于水凝膠骨架的完整組織結(jié)構(gòu)透明標(biāo)本具備大分子滲透作用，因此通過免疫共沉淀方法標(biāo)記目的生物物質(zhì)使之發(fā)生熒光。最后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并構(gòu)建組織細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)。由于組織結(jié)構(gòu)在制備過程中未經(jīng)過物理破壞且被水凝膠完整固定下來，因此CLARITY技術(shù)能完整準(zhǔn)確地反映生理、病理狀態(tài)下組織器官結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化。

CLARITY技術(shù)主要由以下步驟組成：⑴制備以丙烯酰胺為主要成分的水凝膠；⑵制備組織脂質(zhì)清除液；⑶組織標(biāo)本灌注水溶膠，通過器官組織脈管系統(tǒng)注入水凝膠，灌注過程避免空氣注入；⑷組織標(biāo)本水凝膠固定，注意隔絕空氣，避免氣泡形成；⑸電泳主動清除或浸泡被動清楚組織脂質(zhì)，實(shí)現(xiàn)組織標(biāo)本的透明化；⑹組織標(biāo)本研究對象的熒光染色；⑺激光掃描共聚焦顯微鏡三維成像及數(shù)據(jù)分析。CLARITY技術(shù)流程清晰，步驟簡便，易于推廣，且研究對象廣泛，可以應(yīng)用于各種人體及動物器官組織新鮮標(biāo)本，也包括福爾馬林長期浸泡蛋白質(zhì)固定的標(biāo)本。另外針對同一透明標(biāo)本可以通過反復(fù)洗脫抗原抗體，實(shí)現(xiàn)不同研究對象重復(fù)反復(fù)標(biāo)記的不同顏色熒光，再通過激光掃描共聚焦顯微鏡掃描觀察及三維圖像重建，從而分析生理、病理狀態(tài)下各種組織細(xì)胞的相互影響作用的三維空間結(jié)構(gòu)變化，從整體的角度觀察疾病發(fā)生、發(fā)展及治療過程中器官組織結(jié)構(gòu)的微觀變化，為了解疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療過程提供直觀依據(jù)。

3 CLARITY技術(shù)的應(yīng)用

CLARITY技術(shù)問世1年多以來，相關(guān)研究的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)方面的研究，可能與神經(jīng)系統(tǒng)的脂質(zhì)成分相對較多和比較容易透明化有關(guān)。2013年Chung等［1］率先報(bào)道CLARITY技術(shù)并應(yīng)用該技術(shù)構(gòu)建一個(gè)完整的透明小鼠腦組織結(jié)構(gòu)。經(jīng)免疫雜交染色后通過激光掃描共聚焦顯微鏡構(gòu)建小鼠大腦三維空間結(jié)構(gòu)圖。該結(jié)構(gòu)圖顯示了小鼠腦結(jié)構(gòu)中的長段神經(jīng)突觸元結(jié)構(gòu)、局部神經(jīng)回路、神經(jīng)細(xì)胞相互關(guān)系，以及一些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白復(fù)合體、核酸等。Chung等［1］應(yīng)用CLARITY技術(shù)處理自閉癥患者大腦組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)突觸聚集成團(tuán)，無正常有序的神經(jīng)突觸。Spence等［11］應(yīng)用CLARITY技術(shù)制備多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）小鼠模型神經(jīng)系統(tǒng)透明標(biāo)本，觀察發(fā)現(xiàn)脊椎神經(jīng)元數(shù)量和神經(jīng)突觸長度均比正常對照減少。Ando等［12］應(yīng)用CLARITY技術(shù)研究阿爾茨海默爾?。ˋD）腦三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)中不規(guī)則分布淀粉樣蛋白沉積（Aβ），一些表現(xiàn)為密集沉積；另一些表現(xiàn)為彌漫性沉積，伴隨神經(jīng)纖維間斷性神經(jīng)炎表現(xiàn)，且許多神經(jīng)突觸局灶性密集纏結(jié)成團(tuán)。Zhang等［13］制備小鼠神經(jīng)系統(tǒng)透明標(biāo)本以后，觀察到神經(jīng)元鈣離子（Ca2+）結(jié)合蛋白1/2（NECAB1/2）在小鼠脊椎及神經(jīng)節(jié)與疼痛相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞中廣泛分布，是疼痛神經(jīng)回路及相關(guān)神經(jīng)元的分子標(biāo)志物之一。

4 CLARITY技術(shù)的不足及展望

CLARITY作為新技術(shù)仍存在很多不足之處，需要進(jìn)一步優(yōu)化、改進(jìn)［14］。針對標(biāo)本透明化步驟時(shí)間長，過程緩慢的缺點(diǎn)，Yang等［15］在CLARITY技術(shù)基礎(chǔ)上改良灌注和被動透明化過程，使透明化標(biāo)本制備的時(shí)間由原來4～6周縮短為1～2周，并已實(shí)現(xiàn)心、肝、肺、腎、腸道甚至整只小鼠組織的透明化。除此之外，在給較大透明標(biāo)本免疫標(biāo)記的步驟中，雖然提高了抗體濃度和孵育時(shí)間，但被動彌散的抗體滲入透明標(biāo)本的深度仍然有限，目前免疫標(biāo)記500μm的透明標(biāo)本已是該技術(shù)的極限［1］。未來如何實(shí)現(xiàn)免疫標(biāo)記過程中抗體主動轉(zhuǎn)移及結(jié)合仍然是一個(gè)技術(shù)革新的關(guān)鍵點(diǎn)。另外CLARITY技術(shù)不能應(yīng)用于活體組織細(xì)胞中，因此也無法動態(tài)觀察組織細(xì)胞的生理病理變化。有研究者提出通過基因工程技術(shù)培育具備透明化器官組織的轉(zhuǎn)基因動物模型，以此為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)動態(tài)觀察組織細(xì)胞的生理病理變化過程。

目前雖然CLARITY技術(shù)主要成功應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但也有不少研究者嘗試將該技術(shù)應(yīng)用于泌尿、消化、腫瘤等方面的研究，可以預(yù)見近年將出現(xiàn)一個(gè)以CLARITY技術(shù)為基礎(chǔ)的研究高潮。經(jīng)過不斷改良和進(jìn)步，CLARITY技術(shù)必將推動生物醫(yī)學(xué)研究的深入開展。

［1］Chung K，Wallace J，Kim SY，et al.Structural and molecular interrogation of intactbiologicalsystems［J］.Nature，2013，497（7449）：332-337.

［2］Nagakawa T，Mori K，Kayahara M，etal.Three-dimensional studies on the structure of the tissue surounding the superiormessenteric artery［J］. Int JPancreatol，1994，15（2）：129-138.

［3］Hamilton PW，Williamson KE，Grimes J，et al.Three-dimensional computerized analysis of epithelial cell proliferation in the gastrointestinal tract［J］.Br JCancer，1994，69（6）：1027-1031.

［4］Neil MA，Juskaitis R，Booth MJ，et al.Adaptive aberration correction in a two-photonmicroscopye［J］.JMicrosc，2000，200（2）：105-108.

［5］Phillips CL，Arend LJ，F(xiàn)ilson AJ，et al.Three-dimensional imaging of embryonicmouse kidney by two-photonmicroscopy［J］.Am JPathol，2001，158（1）：49-55.

［6］Maik T，Yazdi HM，Burns BF，et al.Pattern of distribution of intraductal and infiltrating ductal cancinoma：a three-dimensional study using serial coronal giant sections of the breast［J］.Hum Pathol，2000，31（4）：464-474.

［7］Griffini P，Smorenburg SM，Verbeek FJ，et al.Three-dimensional reconstruction of colon carcinomametastases in liver［J］.JMicrosc，1997，187（Pt1）：12-21.

［8］Sakata A，Takeda A，Takasaki S.Three-dimensional image analysis of the hepatic restructuring in liver cirrhosis［J］.Anal Quant Cytol Histol，1999，21（2）：181-184.

［9］Saito K，Morita M，Enomoto K.Bronchiolitis obliterans with pemphigus vulgaris and castlemen′s disease of hyaline-vascular type：an autopsy case analyzed by computer-aided 3-D reconstruction of the airway lesios［J］.Hum Pathol，1997，28（11）：1310-1312.

［10］Remuzzi A，Mazeska M，Gephardt GN，et al.Three-dimensional analysis of glomerularmorphology in patients with subtotal nephrectomy［J］. Kidney Int，1995，48（1）：155-162.

［11］Spence RD，Kurth F，Itoh N，et al.Bringing CLARITY to graymatter atrophy［J］.Neuroimage，2014，101：625-632.

［12］Ando K，Laborde Q，Lazar A，et al.Inside Alzheimer brain with CLARITY：senile plaques，neurofibrillary tangles and axons in 3-D［J］.Acta Neuropathol，2014，128（3）：457-459.

［13］Zhang MD，Tortoriello G，Hsueh B，et al.Neuronal calcium-binding proteins 1/2 localize to dorsal root ganglia and excitatory spinal neurons and areregulated by nerve injury［J］.Proc Natl Acad SciU SA，2014，111（12）：E1149-1158.

［14］Tomer R，Ye L，Hsueh B，et al.Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues［J］.Nat Protoc，2014，9（7）：1682-1697.

［15］Yang B，Treweek JB，Kulkarni RP，et al.Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing［J］.Cell，2014，158（4）：945-958.

［2014-12-29收稿］［2015-01-20修回］［編輯阮萃才］

Q503

A

1674-5671（2015）02-03

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81460426）

鄔國斌。E-mail：gb.wu@163.com