湯迪 陶磊

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·綜 述·

MicroRNA在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的研究進展△

湯迪 陶磊

MicroRNA(miRNA)是一組內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達。近年來發(fā)現(xiàn)許多腫瘤的發(fā)生與miRNA水平異常有關(guān)，本文主要就miRNA在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的研究進展進行綜述，包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中miRNA的表達差異、腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制，以及早期診斷、預(yù)后評估和靶向治療的臨床應(yīng)用。

頭頸部腫瘤是目前世界上第六大常見腫瘤，最常見的病理類型是鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)，手術(shù)、放化療是主要治療方式，而患者的5年生存率只有50%，局部復(fù)發(fā)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是主要死因[1]。明確頭頸部鱗癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找早期診斷指標(biāo)，開展有效配合手術(shù)的靶向治療，成為了頭頸部鱗癌研究中的熱點與難點。有研究[2]表明，MicroRNA(miRNA)參與調(diào)節(jié)大部分細(xì)胞學(xué)進程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后中起著重要作用。本文主要就miRNA在頭頸部鱗癌中的研究進展進行綜述。

1 MicroRNA研究概述

1993年，Lee等[3]在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了首個能時序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4，研究者相繼在果蠅、斑馬魚、小鼠、人類等真核生物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了上百個相似的小分子RNA，并將其稱為miRNA。在miRBase發(fā)布的第20次統(tǒng)計數(shù)據(jù)中，目前已在206個物種中發(fā)現(xiàn)了24 521個miRNA基因位點和30 424種各不相同的成熟miRNA序列[4]。

1.1 miRNA的生物學(xué)特性 miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度為20～24個核苷酸，其編碼序列大部分位于基因間隔區(qū)或蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)，在細(xì)胞核內(nèi)通過核苷酸聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為含有帽子結(jié)構(gòu)和多聚核苷酸尾的pri-miRNA，繼而由核酸內(nèi)切酶RNaseⅢ Drosha和雙鏈RNA結(jié)合蛋白DGCRC8/Pasha組成的微處理復(fù)合體加工、切割形成pre-miRNA，其5′端具有磷酸基，3′端具有二核苷酸突出莖環(huán)，并在轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5和Ran-GTP共同作用下轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)核苷酸內(nèi)切酶RNaseⅢ Dicer切割生成雙鏈miRNA，其中1條單鏈為成熟的miRNA。成熟miRNA與一些關(guān)鍵蛋白(如AGO2、GW182)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，以不完全互補的方式和靶基因mRNA的3′端UTR區(qū)結(jié)合，抑制靶基因的翻譯，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達[2]。但近期有研究[5]發(fā)現(xiàn)，miR-10a可以通過與核糖體蛋白mRNA5′UTR結(jié)合，促使其翻譯，提高核糖體的生成，從而正調(diào)控蛋白質(zhì)的總合成量，這一結(jié)果表明某些miRNA也可發(fā)揮正調(diào)控作用。

miRNA通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達，同一miRNA可以調(diào)控多個mRNA，不同的miRNA也可以協(xié)同調(diào)控同一個mRNA，它們之間構(gòu)成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制細(xì)胞及個體的重要生命活動。

1.2 miRNA與腫瘤 既往研究認(rèn)為編碼蛋白的基因異常會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。自從Calin等[6]首次報道與腫瘤相關(guān)性miRNA的研究，人們對腫瘤發(fā)生的機制有了新的認(rèn)識。Calin等在對人類慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)進行研究時，發(fā)現(xiàn)68%的CLL患者攜帶miR-15和miR-16表達水平下降的癌細(xì)胞。在正常情況下，這2種miRNA可作用于線粒體膜的抗凋亡蛋白Bcl-2并抑制其表達，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程。當(dāng)miR-15和miR-16表達下降時，促使Bcl-2蛋白表達增加，抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致CLL發(fā)生。miRNA通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控癌基因、抑癌基因或腫瘤產(chǎn)生途徑中重要分子的表達，分別扮演了癌基因和抑癌基因的角色。

2 miRNA在頭頸部鱗癌中的差異表達及其機制

Chen等[7]對包括218例頭頸部鱗癌樣本和125例對照樣本在內(nèi)的13篇相關(guān)miRNA表達譜研究文獻進行Meta分析，結(jié)果顯示，有67種miRNA表達一致性差異，其中明顯上調(diào)的miR-21、miR-155、miR-130b、miR-31、miR-233和明顯下調(diào)的miR-100、miR-99a、miR-375在進一步的頭頸部鱗癌樣本和對照樣本檢測中得到一致結(jié)果。隨著反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、微陣列芯片等技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，頭頸部鱗癌相關(guān)miRNA表達譜越來越豐富。

Calin等[8]發(fā)現(xiàn)，超過50%的miRNA基因位于腫瘤相關(guān)區(qū)域，如雜合等位基因喪失區(qū)域、癌基因擴增區(qū)域、腫瘤基因組斷裂點和染色體脆性位點，這些區(qū)域是基因缺失、擴增和突變的好發(fā)區(qū)域，miRNA基因位點與腫瘤基因組易變區(qū)域的相關(guān)性缺失影響著miRNA的表達水平。再者，miRNA本身受到其他表觀學(xué)修飾機制的調(diào)控。有研究[9]表明，包括頭頸部鱗癌在內(nèi)的多種實體腫瘤，miR-137的表達下調(diào)與其甲基化存在著相互關(guān)系。此外，miRNA表達水平也與其生物合成障礙有關(guān)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)Drosha對miRNA初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工障礙，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)miRNA表達普遍下調(diào)[10]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)在頭頸部鱗癌發(fā)生中的作用已被認(rèn)同[11]，可通過改變宿主細(xì)胞中miRNA的表達水平影響宿主細(xì)胞的功能。有研究[12]表明，HPV E6蛋白通過對p53的突變作用，下調(diào)miR-34a表達水平，進而提高細(xì)胞的增殖能力。

頭頸部鱗癌組織來源廣泛，而miRNA具有很高的組織特異性，且同一組織不同分化狀態(tài)下其miRNA也不盡相同，造成了目前缺乏明確統(tǒng)一的特異性miRNA作為頭頸部鱗癌的特異性診斷標(biāo)記物。另外，不同的頭頸部鱗癌樣本材料來源，如腫瘤細(xì)胞系、新鮮冷凍組織、10%甲醛溶液固定后石蠟包埋組織、體液等，可能會造成更大的miRNA表達差異[13]。

3 miRNA在頭頸部鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用

miRNA對靶基因?qū)嵭修D(zhuǎn)錄后調(diào)控，異常的表達上調(diào)會抑制抑癌基因的表達，異常的表達下調(diào)則不能有效抑制癌基因的表達，從而調(diào)控頭頸部鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。

3.1 細(xì)胞增殖和凋亡 頭頸部鱗癌的生長特點是原有正常細(xì)胞特性喪失，細(xì)胞惡性增殖能力增強，細(xì)胞凋亡失控，而miRNA是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的重要分子。

有研究[14]表明，miR-21在多種腫瘤組織中表達顯著上調(diào)，可作用于PTEN基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten)、原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)、程序性細(xì)胞死亡基因(programmed cell death 4，PDCD4)等靶基因，促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。Kimura等[15]在頭頸部鱗癌細(xì)胞系和手術(shù)樣本中均發(fā)現(xiàn)miR-21表達顯著上調(diào)，認(rèn)為miR-21通過抑制相關(guān)mRNAs的表達從而導(dǎo)致凋亡級聯(lián)事件的阻斷。喉癌是最常見的頭頸部腫瘤之一，絕大多數(shù)為鱗癌。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-21在喉癌Hep-2細(xì)胞中高表達，敲除miR-21后腫瘤細(xì)胞集落較未敲除組明顯減少，出現(xiàn)G1-S停滯現(xiàn)象。B細(xì)胞異位基因(B-cell translocation gene 2，BTG2)作為一個全細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，是miR-21的作用靶基因之一，通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達和周期素依賴蛋白激酶4蛋白的合成，誘導(dǎo)G1-S期阻滯。異常高表達的miR-21抑制BTG2對G1-S期的阻滯作用，使喉癌細(xì)胞的增殖能力增強。當(dāng)miR-21的抑制作用解除后，BTG2開始發(fā)揮對細(xì)胞周期的阻滯作用，缺失由G1到S期的轉(zhuǎn)換調(diào)控，從而控制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。隨著研究的深入，越來越多的miRNA分子被發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中有著重要作用。

3.2 細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移 侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特性，頭頸部鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移往往導(dǎo)致患者預(yù)后差、生存率低。miRNA作為一種間接調(diào)控因子可參與多種靶基因的調(diào)節(jié)，參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。

上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)的發(fā)生，很大程度地提高了惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲力和轉(zhuǎn)移性。有研究[17]表明，頭頸部鱗癌中mi-R133表達水平的下調(diào)可以通過作用于微囊蛋白1(caveolin-1，CAV1)、肌鈣蛋白3[18](tropmysin，TPM3)等靶基因誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。

Wu等[19]發(fā)現(xiàn)，在喉癌Hep-2細(xì)胞中高表達的miR-16作用于斑聯(lián)蛋白，降低細(xì)胞之間的黏附，提高癌細(xì)胞的遷移能力，促進喉癌的侵襲。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌患者高表達的miR-31可通過降低低氧誘導(dǎo)因子抑制因子(FIH)的表達，間接激活低氧誘導(dǎo)因子(HIF)信號通路，從而誘導(dǎo)血管、淋巴管的生成，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

4 miRNA在頭頸部鱗癌的臨床應(yīng)用

異常表達的miRNA不僅可以應(yīng)用于頭頸部鱗癌的早期診斷，而且對于腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后監(jiān)測也具有一定的指導(dǎo)意義，并為靶向治療提供了新思路。

4.1 早期診斷 分析頭頸部鱗癌、癌前病變、正常組織差異表達的miRNA，有助于早期診斷或輔助判定頭頸部鱗癌癌前病變的惡性轉(zhuǎn)變。Cervigne等[21]通過對非進展性黏膜白斑、進展性黏膜白斑及浸潤型口腔鱗癌患者定期檢測miRNA表達水平，比較不同病變進展期內(nèi)miRNA的表達差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有109種miRNA在進展性黏膜白斑及浸潤型口腔鱗癌中過度表達，其中miR-21、miR-181b和miR-345表達水平與病變進展程度明顯正相關(guān)，表明這3種miRNA在腫瘤形成過程中發(fā)揮著重要作用。通過比較癌前病變與頭頸部鱗癌組織中差異表達的miRNA，不僅可以了解該miRNA在頭頸部鱗癌發(fā)展過程中的作用，而且可以輔助判定頭頸部鱗癌癌前病變的惡性轉(zhuǎn)化，為疾病進展的預(yù)測提供可靠依據(jù)，進而對癌前病變進行合理的治療。

4.2 預(yù)后評估 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否對頭頸部鱗癌患者的預(yù)后具有重要影響，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病理分期常因微小轉(zhuǎn)移灶等因素而具有一定難度。Fletcher等[22]采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測5例良性病變淋巴結(jié)和8例病理證實頭頸部鱗癌陽性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的miR-205表達情況，結(jié)果顯示臨床病理陽性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miR-205明顯高表達，而良性病變淋巴結(jié)幾乎無表達，可以將陽性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)與良性病變淋巴結(jié)區(qū)別開來，并將miR-205作為鱗狀上皮特異性表達的miRNA。研究者繼而用上述方法對細(xì)胞培養(yǎng)的淋巴組織模型檢測，結(jié)果在106個淋巴細(xì)胞中檢測到一個鱗狀細(xì)胞，進一步證實該方法在檢測鱗狀上皮來源的組織具有極高的敏感度。此法有望成為一種新的評估頭頸部鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，從而避免對無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的過度治療。

4.3 靶向治療 miRNA作為一種表觀遺傳修飾，其改變具有可逆性。當(dāng)具有抑癌基因功能的miRNA表達下調(diào)時，可以通過外源性補充相應(yīng)前體及類似物進行替代治療，增強其功能從而抑制腫瘤生長；當(dāng)具有癌基因功能的miRNA表達上調(diào)時，可以通過miRNA抑制物調(diào)節(jié)靶mRNA及其蛋白的表達水平，從而控制腫瘤惡性增殖和促進細(xì)胞凋亡。

Cai等[23]發(fā)現(xiàn)，miR-34c在喉鱗癌細(xì)胞中表達下調(diào)，通過反轉(zhuǎn)錄病毒載體將miR-34c轉(zhuǎn)導(dǎo)入Hep-2細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)該miRNA分子可以顯著抑制Hep-2細(xì)胞的生長和侵襲能力，預(yù)示 miR-34c 可以成為臨床治療的潛在靶點。

化療是頭頸部腫瘤的治療手段之一，但腫瘤細(xì)胞多重耐藥性仍是化療失敗的主要原因。Yu等[24]發(fā)現(xiàn)，在對順鉑產(chǎn)生耐藥性的口腔鱗癌細(xì)胞系中，miR-23a、miR-214表達上調(diào)，miR-21表達下調(diào)。當(dāng)miR-23a、miR-214表達失活和miR-21表達復(fù)蘇后，該口腔鱗癌細(xì)胞系對順鉑的耐藥性減弱，這預(yù)示著miRNA在抑制腫瘤細(xì)胞耐藥性、提高頭頸部鱗癌對化療藥物敏感度等方面發(fā)揮一定作用。

5 展望

目前對于miRNA的研究尚存在很多挑戰(zhàn)。至今缺乏明確的特異性miRNA作為頭頸部鱗癌的特異性診斷標(biāo)記物，miRNA在頭頸部鱗癌發(fā)生、發(fā)展的各個階段起關(guān)鍵性作用的分子機制也尚不清楚，例如，miRNA表達水平的變化是如何開始和維持？miRNA和目前已知的各種癌基因、抑癌基因、信號通路等是如何相互作用？表達差異的miRNA哪些是“致癌因素”？哪些是“從屬變化”？由于單個miRNA表達變化可以改變下游許多靶基因的表達，如何改善治療的靶向性、減少副反應(yīng)的發(fā)生成為了治療難點。此外，目前研究多停留在以頭頸部鱗癌細(xì)胞系為實驗?zāi)Ｐ偷脑囼炿A段，如何將實驗結(jié)果應(yīng)用于臨床，需要更深入的研究。

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(本文編輯 楊美琴)

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復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻咽喉科 上海 200031

陶磊(Email：doctortaolei@163.com)

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