[摘要] 隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步和完善，其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷的擴(kuò)大。近年來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中藥炮制研究中已得到廣泛應(yīng)用，如不同炮制品之間的藥效作用比較、炮制減毒作用的研究及炮制原理的分子機(jī)制探討等。本文就細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中藥炮制研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)目前研究中出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行分析，為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中藥炮制研究中的深入應(yīng)用提供參考。

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A

[文章編號(hào)] 1674-926X(2015)05-018-04

[作者單位] 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

[作者簡(jiǎn)介] 李江維，女，2014級(jí)藥劑學(xué)碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹兴幣谥菩鹿に嚰芭谥圃硌芯?/p>

[通訊作者] 許潤(rùn)春，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橹兴幣谥菩鹿に嚰芭谥圃硌芯縀mail:309786953@qq.com

[收稿日期] 2014-12-16

Application of cell culture in the study of process of traditional Chinese Medicine Study

/LI Jiang-wei, XU Run-chun,

WANG Peng-fei //( Chengdu university of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

[Abstract] The application fields are expanding with the constant progress of cell culture technology. In recent years, cell culture technology has been widely used in the study of processing of Traditional Chinese Medicine. For example, it can be used in the comparison of effects among different processed products, toxicity attenuation research after processing, and investigation of molecular mechanism of processing theory and so on. The application of cell culture in the study of processing is reviewed and the problems in the present study are analyzed in this paper to provide reference for the further application of cell culture in the study of processing.

[Key words] Cell culture; processing of traditional Chinese Medicine; the role of processing; the theory of processing

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指將動(dòng)物活體體內(nèi)取出的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單細(xì)胞懸液，然后放在類(lèi)似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使其生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)與功能的方法 [1]。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快捷等特點(diǎn)，在藥物研究領(lǐng)域主要用于檢測(cè)各種藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線計(jì)數(shù)細(xì)胞增長(zhǎng)的絕對(duì)指數(shù)，直觀地了解細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡的動(dòng)態(tài)變化，從而反應(yīng)出藥物的作用。中藥在臨床應(yīng)用前，都需經(jīng)過(guò)炮制制成炮制品方能入藥。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可研究比較不同炮制品的藥效作用、毒性的變化及藥物的分子作用機(jī)制和炮制原理，并且可通過(guò)研究所得結(jié)果初步篩選出中藥炮制的最佳工藝條件。本文就細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中藥炮制現(xiàn)代研究中的應(yīng)用作一綜述。

1　細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在炮制作用研究中的應(yīng)用

中藥在臨床應(yīng)用前，需通過(guò)炮制加工成一定規(guī)格和質(zhì)量要求的飲片，中藥的不同炮制品，其藥性、用法、作用等均有所不同。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)可在較短的時(shí)間內(nèi)比較得出中藥不同炮制品的作用，大幅提高研究效率。

徐剛等 [2]采用CCK-8法篩選出酒狗脊為最佳炮制品，其促成骨細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。陸躍鳴等 [3]采用體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的方法，直接觀察生半夏、姜浸半夏、姜煮半夏、礬半夏、姜礬半夏五種半夏炮制品中總生物堿對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用及形態(tài)損傷作用，結(jié)果顯示姜浸半夏在低濃度時(shí)作用就較明顯，而在高濃度時(shí)礬半夏作用最明顯。吳皓等 [4]還研究半夏及其姜制抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用，結(jié)果表明，姜浸半夏、礬半夏、姜礬半夏對(duì)細(xì)胞的損傷作用均較明顯，而姜浸半夏作用最強(qiáng)。對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用，仍以姜浸半夏最佳。此外，周信等 [5]研究表明生半夏、清半夏、姜半夏、法半夏之間作用強(qiáng)度存在差異，生半夏對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子分泌抑制作用強(qiáng)于炮制品。陸平成等 [6]表明高壓炮制的藤黃對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng)，而對(duì)艾氏腹水瘤細(xì)胞則高壓制、荷葉、山羊血和水制的藤黃效果較好。對(duì)正常的腹腔巨噬細(xì)胞而言，則豆腐炮制的藤黃毒性最強(qiáng)。結(jié)果還提示炮制時(shí)所用的各種輔料對(duì)藤黃的細(xì)胞毒作用影響不大，影響其細(xì)胞毒作用的主要是炮制的溫度和時(shí)間。王耿等 [7]研究藤黃及其炮制品對(duì)K562腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果表明生藤黃、清水煮藤黃、高壓蒸制藤黃、豆腐制藤黃、荷葉制藤黃、山羊血制藤黃對(duì)K562腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，其中高壓蒸制藤黃的抑制作用最強(qiáng)。易春霞等 [8]研究何首烏不同炮制品對(duì)H 2O 2致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，與何首烏生品相比較，清蒸和黑豆汁蒸均可加強(qiáng)何首烏保護(hù)PC12細(xì)胞免受H 2O 2損傷的作用。王敏江等 [9]研究何首烏不同炮制品對(duì)肝細(xì)胞脂代謝的干預(yù)作用，結(jié)果表明生何首烏及何首烏傳統(tǒng)炮制品、發(fā)酵炮制品均有顯著地降脂作用，其中米根霉發(fā)酵得到的發(fā)酵品的降脂活性較好，并提示發(fā)酵法可能成為何首烏炮制法研究的新方向。焦艷等 [10]研究比較麥冬酒制前后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧保護(hù)作用，結(jié)果表明麥冬酒制后更能顯著拮抗缺氧對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。李佳川等 [11]運(yùn)用生物效應(yīng)法從細(xì)胞途徑研究不同黃連炮制品“止消渴”藥效，結(jié)果表明黃連生品、萸制黃連、酒炙黃連、酒蒸黃連、姜制黃連、醋制黃連六種黃連炮制品均能明顯或部分降低培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，提高脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率，同時(shí)在一定劑量范圍可明顯促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖。在對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響上，各炮制品在一定劑量下抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化。其綜合作用與生品比較，萸制黃連、酒蒸黃蓮、酒炙黃連均較明顯。潘新等 [12]研究復(fù)方二神丸中補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制后對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群cAMP/cGMP的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明補(bǔ)骨脂鹽炙、肉豆蔻煨炙后入藥組大鼠比補(bǔ)骨脂、肉豆蔻生品入藥組的恢復(fù)效果好，補(bǔ)骨脂和肉豆蔻在炮制后對(duì)模型大鼠的CD 3+CD 4+，CD 3+CD 8+，cAMP/cGMP調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)。并提示其增強(qiáng)脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠的止瀉作用可能與調(diào)節(jié)模型大鼠的T細(xì)胞亞群和cAMP/cGMP水平的平衡有關(guān)。郭重儀等 [13]研究不同炮制方法的巴戟天對(duì)小鼠抗氧化及細(xì)胞免疫功能的影響，結(jié)果表明生曬及鹽制巴戟天均可提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及NK細(xì)胞殺傷功能，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫，其生曬品比鹽制品作用效果好。徐勇等 [14]研究炒麥芽含藥血清對(duì)MMQ大鼠垂體瘤細(xì)胞增殖影響，結(jié)果表明中、高劑量組炒麥芽含藥血清對(duì)瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，并隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用慢慢減弱，而低劑量炒麥芽在48h前隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)可促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖，48 h后這種作用發(fā)生翻轉(zhuǎn)。表明炒麥芽對(duì)垂體泌乳素腺瘤增殖具有雙重作用。李召等 [15]研究比較不同加工工藝鹿茸組分對(duì)慢性再生障礙性貧血患者骨髓造血細(xì)胞體外增殖的影響，結(jié)果表明冷工藝鹿茸對(duì)再障骨髓細(xì)胞的增殖作用明顯且優(yōu)于熱榨茸。卓麗紅 [16]等研究制何首烏對(duì)大鼠造血祖細(xì)胞增殖及骨髓細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響，結(jié)果表明首烏經(jīng)過(guò)蒸制后能明顯促進(jìn)粒系造血祖細(xì)胞的增殖，并且能夠明顯降低骨髓抑制大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞黏附分子CD54的表達(dá)。趙鳳鳴等 [17]研究山茱萸生、制品二氯甲烷萃取部位對(duì)D-半乳糖致衰人胚肺細(xì)胞影響，結(jié)果表明生山茱萸、酒制山茱萸水煎液去多糖二氯甲烷萃取部位對(duì)D-半乳糖致衰人胚肺細(xì)胞具有一定保護(hù)作用，但二者之間無(wú)顯著差異。趙青春等 [18]研究發(fā)現(xiàn)生山茱萸及酒制山茱萸二氯甲烷萃取部位對(duì)D-半乳糖致衰小鼠骨髓細(xì)胞表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，且酒制山茱萸二氯甲烷萃取部位保護(hù)作用更明顯。

由上可知，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以用于中藥不同炮制品之間作用的比較，可在較短時(shí)間內(nèi)篩選出治療作用更佳的炮制品，分析出中藥炮制過(guò)程中影響藥物作用的因素，為中藥炮制方法、工藝、輔料的研究和優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。

2　細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在炮制減毒研究中的應(yīng)用

沈煒等 [19]研究雷公藤不同炮制品對(duì)人胚肝細(xì)胞L-O2增殖的影響，結(jié)果表明酒蒸、煅炭、醋蒸、羊血燉等方法炮制后的雷公藤對(duì)人胚肝細(xì)胞的毒性比飲片更小，并提示雷公藤可通過(guò)這4種炮制方法來(lái)降低肝臟毒性。劉偉杰等 [20]采用體外培養(yǎng)Lewis細(xì)胞，研究斑蝥酒制品對(duì)小鼠肺癌的影響，結(jié)果表明斑蝥經(jīng)酒浸泡后可在保持抗腫瘤活性基礎(chǔ)上降低其毒性。張麗等 [21]研究不同方法炮制甘遂對(duì)LO2細(xì)胞周期與凋亡的影響，結(jié)果表明甘遂炮制后可降低其對(duì)LO2細(xì)胞的毒性，而且甘遂醋制工藝中的炒與醋潤(rùn)2種操作在醋制降低甘遂的肝毒性中能夠起到協(xié)同作用。曹雨誕等 [22]研究醋制京大戟對(duì)小腸隱窩上皮細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明醋制可降低京大戟對(duì)腸細(xì)胞的毒性。李福全等 [23]研究蒙藥訶子湯制草烏總生物堿對(duì)乳大鼠心肌細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明訶子湯炮制的草烏總生物堿對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用明顯低于生草烏總生物堿，由此提示采用訶子湯炮制能降低草烏的心肌毒性。

由上述可知，運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)分析出不同炮制品細(xì)胞毒性作用的大小，并可根據(jù)研究結(jié)果篩選出減毒的最佳炮制方法，同時(shí)提示新的炮制減毒方法。

3　細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在炮制原理研究中的應(yīng)用

馮麗敏等 [24]研究醋柴胡水提液對(duì)人胚腎細(xì)胞HEK293中MRP1影響的作用機(jī)制，結(jié)果表明醋柴胡能增加胞內(nèi)MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)底物秋水仙堿的外排，但可能并非通過(guò)改變MRP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)。趙瑞芝等 [25]對(duì)醋柴胡小分子水溶性部位抑制HEK293-Pgp細(xì)胞中P糖蛋白的外排功能進(jìn)行研究，初步探索得出醋柴胡小分子水溶性部位對(duì)P糖蛋白抑制作用具有選擇性，醋柴胡小分子水溶性部位有可能實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)抗癌藥療效的作用，且作用位點(diǎn)可能在基因水平，提示醋柴胡引經(jīng)作用的位點(diǎn)可能在基因水平。陳海鷹等 [26]研究醋制降低京大戟對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2的毒性機(jī)制。結(jié)果表明其減毒機(jī)制可能是減輕細(xì)胞氧化損傷，從而降低細(xì)胞周期阻滯，減少細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步闡明京大戟醋制減毒的機(jī)制提供了依據(jù)。顏曉靜等 [27]采用體外培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞，初步探討甘遂醋炙減毒機(jī)制。研究結(jié)果提示在甘遂醋炙過(guò)程中加熱和醋潤(rùn)兩個(gè)炮制程序能夠起到降低甘遂致炎毒性的協(xié)同作用，為探討甘遂醋炙減毒機(jī)制提供了一定的依據(jù)。唐丹霞等 [28]研究厚樸汁炙遠(yuǎn)志含藥血清對(duì)胃Cajal 間質(zhì)細(xì)胞活力及nNOS表達(dá)的影響，結(jié)果表明厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品緩解胃動(dòng)力障礙的分子生物學(xué)機(jī)制，可能與下調(diào)胃Cajal 間質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)nNOS，促進(jìn)胃Cajal 間質(zhì)細(xì)胞活力有關(guān)。吳有蓮等 [29]研究了制何首烏對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)理，結(jié)果表明其作用機(jī)理可能與上調(diào)成骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。李淑雯等 [30]研究香附醋制前后對(duì)Caco-2細(xì)胞P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響，結(jié)果顯示香附醋制后對(duì)P-糖蛋白的功能和表達(dá)呈現(xiàn)出抑制作用，由此說(shuō)明柴胡醋制增效的機(jī)理可能是抑制P-糖蛋白對(duì)藥物的外排，從而增加藥物濃度，提高藥效。余小華等 [31]研究炒麥芽含藥血清對(duì)MMQ大鼠垂體瘤細(xì)胞NGF、PRL分泌表達(dá)的影響，結(jié)果顯示低劑量炒麥芽和中劑量炒麥芽均可以促進(jìn)NGF少量分泌，此時(shí)NGF與受體trkA結(jié)合而使垂體瘤細(xì)胞PRL激素的分泌增加，而大劑量炒麥芽含藥血清干預(yù)垂體瘤細(xì)胞時(shí)NGF分泌量較大，NGF則與P75受體結(jié)合，從而啟動(dòng)誘導(dǎo)垂體瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程，進(jìn)而抑制PRL激素的分泌。由此說(shuō)明炒麥芽可能是通過(guò)上調(diào)NGF的分泌進(jìn)而抑制PRL激素的分泌。唐丹霞等 [32]研究厚樸汁炙遠(yuǎn)志對(duì)小鼠胃Cajal 間質(zhì)細(xì)胞Ca 2+通道的影響，結(jié)果顯示厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品能明顯緩解遠(yuǎn)志對(duì)正常小鼠胃Cajal 細(xì)胞Ca 2+通道損傷，維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)胞活力，其機(jī)制可能是升高細(xì)胞外液Ca 2+量、減弱對(duì)ATP酶活力的影響及降低胃間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)1，4，5-三磷酸肌醇水平，起到緩解因遠(yuǎn)志導(dǎo)致胃腸動(dòng)力紊亂所致的胃動(dòng)力障礙。

4　細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中藥炮制研究其他方面的應(yīng)用

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中藥炮制品作用研究中的應(yīng)用除上述三個(gè)方面，也應(yīng)用在炮制品有效成分或有效提取部位的篩選。于海濤等 [33]對(duì)狗脊炮制品中促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的成分進(jìn)行了篩選。鞠成國(guó)等 [34]研究狗脊生、制品不同提取部位對(duì)成骨細(xì)胞的影響，結(jié)果表明狗脊正丁醇提取部位對(duì)細(xì)胞增殖作用最明顯。通過(guò)對(duì)炮制品有效成分和有效提取部位的研究，也可為研究中藥炮制的新方法提供參考依據(jù)。此外，王萬(wàn)根等 [35]研究何首烏高壓蒸制法蒸制時(shí)間對(duì)何首烏抗衰老活性影響，在壓力為150 kPa，溫度為121℃的條件下分別加壓炮制1 h、2 h、3 h、4 h，最后篩選出高壓蒸制法炮制何首烏的最佳炮制時(shí)間為3 h。

5　結(jié)論與討論

與動(dòng)物整體作為研究對(duì)象比較，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有準(zhǔn)確控制藥物作用對(duì)象、時(shí)間、劑量以及細(xì)胞生長(zhǎng)條件的優(yōu)點(diǎn)，可直接觀察藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的影響，在大型動(dòng)物作為研究對(duì)象時(shí)，還具有耗資少的優(yōu)點(diǎn)。此外該技術(shù)還具有實(shí)驗(yàn)周期短、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠等特點(diǎn)。

綜上所述，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中藥炮制增效、減毒以及炮制原理研究等方面已得到廣泛的應(yīng)用，在炮制工藝研究方面也有報(bào)道，為中藥炮制的現(xiàn)代化研究注入了新的生機(jī)。目前細(xì)胞大多是在一種有限的二維的生長(zhǎng)空間內(nèi)培養(yǎng)，在此條件下雖然可使細(xì)胞維持生長(zhǎng)、繁殖，但相對(duì)于機(jī)體這個(gè)系統(tǒng)來(lái)講，仍存在很大的差異，所以由此研究所得結(jié)果不能等同于在體內(nèi)研究的結(jié)果。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步和完善，細(xì)胞培養(yǎng)體系已從二維發(fā)展到三維，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中細(xì)胞生長(zhǎng)的生理微環(huán)境與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的生理微環(huán)境更加相近，研究結(jié)果更加接近體內(nèi)研究結(jié)果，因此更具參考價(jià)值。可運(yùn)用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究炮制對(duì)中藥藥效的影響，以避免實(shí)驗(yàn)療效顯著而臨床效果下降的現(xiàn)象，篩選出治療效果顯著的炮制品和更加優(yōu)異炮制條件及可靠的炮制方法，從而指導(dǎo)優(yōu)化炮制條件，指示新的炮制方法。也可用于研究細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用對(duì)藥物作用的影響，進(jìn)一步闡明藥物作用機(jī)制，為研究炮制增效減毒等傳統(tǒng)的炮制理論奠定基礎(chǔ)。