李艷青朱秀高王潤錦

（1濰坊科技學院生物研發(fā)中心，山東壽光262700；2中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京100193；3武漢回盛生物科技有限公司，湖北武漢430042；4西藏山南地區(qū)畜牧獸醫(yī)總站，西藏山南856000）

分子生物學技術在豬藍耳病病原檢測中的應用

李艷青1朱秀高2,3*王潤錦4

（1濰坊科技學院生物研發(fā)中心，山東壽光262700；2中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京100193；
3武漢回盛生物科技有限公司，湖北武漢430042；4西藏山南地區(qū)畜牧獸醫(yī)總站，西藏山南856000）

摘要：藍耳病是目前國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)所面臨的第一大病，它帶來的危害比豬瘟更嚴重，由其引發(fā)的免疫抑制，使感染藍耳病的豬場豬只的健康狀況顯著惡化，因此生產(chǎn)中需要及時對其感染情況進行監(jiān)測。本文對藍耳病出現(xiàn)以來特別是在國內(nèi)發(fā)生后，藍耳病病毒檢測中主要使用到的分子生物學技術進行分析討論，并對這些方法的使用條件進行了說明。

關鍵詞：藍耳??；病原；檢測；分子生物學

豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS），于20世紀80年代中后期首先在美國出現(xiàn)，其后加拿大報道了該病的流行。歐洲的德國和荷蘭于1990年開始有了該病的暴發(fā)，1992年歐共體將其命名為PRRS[1]。我國的感染開始于20世紀90年代中期，1995年北京地區(qū)豬群發(fā)病后，郭寶清等[2]于1996年從發(fā)病豬中分離出病毒并鑒定為PRRSV。2006年開始，一種更為嚴重的PRRS在豬群中出現(xiàn)[3]，楊漢春等[4]對該病進行研究后發(fā)現(xiàn)本次導致豬群發(fā)病的病毒與之前的流行株相比，基因結構發(fā)生了改變，遂將其命名為高致病性豬藍耳病病毒（HP-PRRSV）。Lunneyl等報道HP-PRRSV還出現(xiàn)在越南和柬埔寨等國[5]。

根據(jù)調(diào)查，目前國內(nèi)豬場中普遍存在PRRSV和HP-PRRSV的混合感染，給其防控帶來極大困難。楊彩然等[6]對2007—2010年河北部分地區(qū)分離株的分析顯示，大部分流行株為高致病性毒株，這些毒株GP5蛋白的糖基化位點數(shù)量和位置已經(jīng)發(fā)生了變化。而依據(jù)現(xiàn)有對PRRSV免疫的認識，同源性越高的疫苗對豬的免疫保護力越強，因此豬場控制PRRSV的流行，必須定期對場內(nèi)病毒的流行情況進行監(jiān)測。

近年來隨著新技術的出現(xiàn)，越來越多的檢測方法被應用于PRRSV的臨床檢測。不過在應用中，我們發(fā)現(xiàn)很多方法受制于檢測設備、操作人員和操作環(huán)境，一方面不能大范圍推廣應用，另一方面結果的可重復性和準確性等受到很大影響。為了對PRRSV的檢測技術有清晰的認識，本文對分子生物學技術在豬藍耳病病原檢測中的應用進行了分析。

1　RT-PCR

進行RT-PCR檢測的關鍵在于設計合適的引物和建立系統(tǒng)化的反應條件，其中引物的設計決定了方法的準確性和特異性。PRRSV的基因組大小約為15kb，含9個開放性閱讀框（ORF），其中ORF1編碼病毒的非結構蛋白，ORF2～7編碼病毒的結構蛋白。根據(jù)血清學和基因序列分析，PRRSV分為兩種血清型：I型（歐洲型）和II型（美洲型），兩型之間病毒核酸序列同源性約為60%；同型之內(nèi)不同毒株間的核酸同源性又有差異，其中美洲型毒株間ORF2的核酸同源性為96%～98%、ORF3為92%～98%、ORF4為92%～99%、ORF5為90%～98%、ORF6和ORF7為96%～100%[7]。因此，設計引物時應充分考慮針對不同區(qū)域的保守性，以使建立的方法敏感性和準確性達到最佳。

Suarez等[8]首先報道了應用RT-PCR技術進行I型PRRSV診斷的技術，他們采用針對ORF7片段的引物、擴增后得到大小為312 bp的產(chǎn)物，對試驗感染豬的病變組織檢測靈敏度可以達到102TCID50，且對其他7種豬源病毒無擴增效果。蔡家利等[9]在國內(nèi)首次報道了RT-PCR檢測II型PRRSV的技術，其設計了能同時擴增ORF6（M蛋白）和ORF7（N蛋白）片段的引物，對流產(chǎn)胎兒組織進行檢測后得到了918 bp的片段，進一步用酶切鑒定和序列分析等方法確認該片段為PRRSV。在此之后很多研究者建立的RT-PCR方法都是以ORF7 或ORF6為對象設計引物[10,11]，也有一些方法針對的區(qū)域為ORF5，如吳庭才等[12]用建立的方法對經(jīng)各種診斷方法鑒定為陽性的16個病例進行組織的病原擴增后，得到所有病例均為陽性的檢測結果，符合率達到100%。

上述方法建立時，研究人員所采用的參考對象均為GenBank中已經(jīng)存在的病毒基因序列，且多數(shù)為經(jīng)典毒株如VR2332或LV株。2006年國內(nèi)出現(xiàn)HP-PRRSV感染后，楊漢春及其他研究者針對病毒基因組的研究發(fā)現(xiàn)，與2006年之前的流行株相比，病毒存在明顯的基因缺失，是一種新的變異株[4]，因此2006年之后進行臨床病例的實驗室檢測時就要考慮經(jīng)典毒株和變異毒株的鑒定問題。由于病毒的變異區(qū)域位于Nsp2處，所以進行鑒別診斷的方法在引物設計時都是以此區(qū)域作為參考。劉忠華等[13]針對HP-PRRSV Nsp2基因的缺失信息，設計了3條特異性引物，所建立的RT-PCR診斷方法能夠快速區(qū)分經(jīng)典PRRSV和HP-PRRSV，其敏感性可達0.265 pg，對52個豬場送檢184份病料的檢測結果顯示有42個豬場的122樣品為HP-PRRSV陽性、1份為經(jīng)典PRRSV陽性。張燕霞等[14]參考CH-1a和JXA1的基因序列，設計了一對跨越Nsp2基因缺失區(qū)的引物，利用這一引物建立的方法對經(jīng)典PRRSV的擴增片段為511 bp、對HP-PRRSV的擴增片段為421 bp，可以很方便地根據(jù)Marker條帶進行結果判定，其靈敏度達10～3 ng，對5個省份的126份病料檢測后，有65份為HP-PRRSV、2份為經(jīng)典PRRSV。與普通RT-PCR一樣，研究人員建立的各種鑒別診斷方法在判定結果時都有其各自的標準，如梁民等[15]建立的方法為332 bp（經(jīng)典株）和241 bp（變異株）、王龍柏等人建立的方法為307 bp（經(jīng)典株）和217 bp（變異株）[16]。因此，實驗室對送檢病料進行檢測，特別是出具報告時，一方面要對所使用的檢測方法進行說明，另一方面最好將結果進行文字解讀，以方便送檢人員對結果的理解，避免造成不必要的誤解。此外，HP-PRRSV與高致病性疫苗株的鑒別診斷也是臨床需要的檢測技術。何玲等[17]根據(jù)公開的基因序列，設計了兩對分別針對JXA-1野毒株和JXA-1疫苗株的特異性引物，經(jīng)過RT-PCR反應后分別得到400 bp和290 bp的兩個片段，可以用于二者的同時鑒定。目前國內(nèi)應用的高致病性疫苗株還有TJM92株和Hun4株，根據(jù)一些報道資料，這兩個疫苗株也有了可以進行鑒定的RT-PCR技術。

從臨床及實驗室檢測應用來看，設計好合適的引物后，還應注意方法所適用的待檢材料。根據(jù)報道，目前RT-PCR檢測中用到的材料主要為病料組織、流產(chǎn)胎兒、血清和精液，也有一些為口腔唾液拭子或鼻拭子，還有的為糞便樣品。其中口腔唾液拭子作為一種近年來興起的樣品采集技術由于對豬只的刺激性極小、降低了采樣人員的勞動強度而深受歡迎[18]，但目前國內(nèi)還缺乏此類采樣方法的系統(tǒng)化標準，因此需要進一步對該方法進行研究規(guī)范，以減少采樣的污染、提高樣品的可靠性。

2　熒光定量RT-PCR

與RT-PCR相比，熒光定量RT-PCR技術在1996年才出現(xiàn)，其是在反應體系中加入能夠發(fā)出熒光的基團，通過熒光信號的發(fā)出實時監(jiān)測整個反應進程，最后通過標準曲線對待檢物進行定量分析，因此又稱為實時熒光定量RT-PCR[19]。目前實驗室中用到的這一技術主要由Taq Man熒光定量RT-PCR和SYBR Green I熒光定量RT-PCR，二者的區(qū)別在于用到的反應產(chǎn)物指示系統(tǒng)不同。祝秀梅等[20]2010年對熒光定量RT-PCR在PRRSV檢測中的應用進行了回顧分析，主要從定量檢測、鑒別診斷和混合感染診斷三個方面重點論述了該方法的應用，同時指出該方法應用受到限制的因素。之后關于該方法的研究更多地集中于對變異株的檢測及變異株和經(jīng)典株的鑒別診斷。方桂友等[21]應用建立的Taq Man熒光定量RT-PCR技術對HP-PRRSV在人工感染豬體內(nèi)的分布情況進行了研究，結果顯示淋巴器官、肺、血液和腦等組織器官中病毒的含量最高。高詩敏等[22]應用1對特異性鑒別引物和1條Taq Man探針建立了熒光定量RT-PCR方法，其可以有效鑒別變異株和經(jīng)典株，且靈敏度為常規(guī)RT-PCR的100倍，對13份疑似病例檢測后有11份呈陽性。晏勇邦等建立的方法也與此相似，其最低檢測限達到102TCID50[23]。

3　RT-LAMP

環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術由Notomi等在2000年發(fā)明，它是一種基于單鏈環(huán)狀結構的核酸擴增技術，針對靶基因的6個特異性部位設計4對引物，使用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下合成新鏈，從而高效擴增靶基因。國內(nèi)較早開始該方法用于PRRSV檢測的專家為陳長木等人，他們利用針對N基因的引物，建立了RT-LAMP方法，在恒溫作用1小時就可以得到特異性條帶，對其他病原的檢測為陰性，與RT-PCR的結果符合率為96.2%[24]。除了針對N基因建立的方法外，趙彥榮等建立了針對M基因[25]、鄧顯文等建立了針對Nsp2基因[26]、張躍偉等建立了針對M+N基因[27]的方法，其參考毒株有的為經(jīng)典株、有的為變異株，這些方法從報道來看均能對PRRSV進行擴增呈陽性反應。曾少靈等[28]分別針對經(jīng)典株的N基因和變異株的Nsp2基因各設計了6條引物，建立了同時進行的RT-LAMP方法，58份臨床病料的檢測結果顯示與熒光定量RT-PCR的結果一致，且RT-LAMP的靈敏度比實時熒光RT-PCR法高出約10倍，可以進行經(jīng)典株和變異株的鑒別診斷。

檢測中使用RT-LAMP方法，一方面是由于其不需要昂貴的反應設備，且條件簡單，另一方面是反應產(chǎn)物可以通過電泳、濁度和熒光等進行檢測，特別是利用熒光檢測，可以通過加入一定的染料來實現(xiàn)檢測結果的目測。目前資料報道中使用到的染料有Gene Finder、SYBR GREEN I[25]和鈣黃綠素[26]等，特別是后者的使用更為簡單。

近年來隨著規(guī)?；B(yǎng)殖企業(yè)的增多，年出欄幾十萬頭甚至百萬頭的單體養(yǎng)豬場越來越多，單位面積內(nèi)豬的密度也越來越大，由此疾病感染的風險也隨之增加，特別是一些混合感染性疾病在目前發(fā)病中占了絕大多數(shù)。臨床上，要想對疾病起到好的治療效果，正確的診斷是關鍵，而混合感染的出現(xiàn)對以往靠經(jīng)驗進行診斷的方式提出了嚴峻考驗。所以在當前養(yǎng)殖形勢下，需要我們更多地應用一些技術性手段進行疾病診斷。

豬群發(fā)病時，對診斷的要求有兩個方面，即準確和快速。具體到PRRS而言，懷疑發(fā)病豬感染PRRSV時，在當前需要我們利用診斷技術進行兩個方面的檢測：是否感染PRRSV和感染了哪一類型PRRSV（經(jīng)典株或變異株），這些都涉及到病原的檢測問題，在以前可能要進行兩次或者多次檢測，甚至要用到測序等更為復雜的技術，現(xiàn)在隨著新技術的應用，進行一次檢測就能得到我們所需要的結果。不過在實際應用中，我們還要考慮不同技術所適用的情形，如在生產(chǎn)現(xiàn)場進行檢測，可能更側重于技術的快速性和方便性，而在實驗室檢測更側重于技術的準確性。所以應用技術對病原進行檢測時，應進行綜合選擇。

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中圖分類號：S858.28

文獻標識碼：B

文章編號：1673-4645(2015)05-0063-04

收稿日期：2015-02-02

作者簡介：李艷青（1983-），女，山東濰坊人，博士，E-mail：zhuxiugaao@163.com

*通訊作者：朱秀高