屈平平，李　濤，胡士林

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院， 山東 濰坊 261061)

熱應(yīng)激抑制哺乳動物早期胚胎發(fā)育的作用機理及Hsp70的保護作用

屈平平，李濤，胡士林*

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院， 山東 濰坊 261061)

夏季高溫是哺乳動物的繁殖性能降低的重要原因。熱應(yīng)激通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、促使細胞凋亡、阻礙細胞有絲分裂等機理抑制早期胚胎發(fā)育。而熱休克蛋白70可以通過分子伴侶作用、誘導(dǎo)熱耐受性、抑制細胞凋亡、抵抗氧化應(yīng)激、參與細胞增殖等方式發(fā)揮其對胚胎的保護作用。

熱應(yīng)激；哺乳動物；早期胚胎；熱休克蛋白70

高溫?zé)釕?yīng)激是夏季哺乳動物不孕和妊娠失敗的主要原因之一。研究表明，熱應(yīng)激能降低公畜的精液品質(zhì)和母畜的卵母細胞質(zhì)量，使得卵母細胞受精能力和受精后胚胎的發(fā)育能力降低[1,2]；母畜在妊娠早期遭受熱應(yīng)激后，胚胎的死亡率和畸形率也明顯增加[3]。但是，哺乳動物早期胚胎對熱應(yīng)激的敏感性具有發(fā)育階段性，當(dāng)胚胎發(fā)育至囊胚時，可以通過短暫的溫和熱應(yīng)激誘導(dǎo)胚胎獲得一定的熱耐受性，有與熱休克蛋白70的保護作用有一定的關(guān)系。

1　熱應(yīng)激抑制哺乳動物早期胚胎發(fā)育的作用機理

1.1誘導(dǎo)氧化應(yīng)激

活性氧是天然氧代謝的產(chǎn)物，代表著1%～2%的代謝氧。氧化物質(zhì)的產(chǎn)生和及時清除維持著細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。當(dāng)自由基產(chǎn)生增多，清除能力下降時，自由基就會在體內(nèi)積蓄，影響細胞及細胞器正常的生理結(jié)構(gòu)和功能。動物遭受熱應(yīng)激時，機體的代謝率增加，細胞溫度升高，激活了許多促使自由基產(chǎn)生的酶如黃嘌呤氧化酶，使得機體活性氧產(chǎn)生增多；活性氧再與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸一起作用，導(dǎo)致細胞發(fā)生損傷。自由基的增多對體外培養(yǎng)的胚胎是致命的，通常會導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯和胚胎退化。Ozawa等發(fā)現(xiàn)，母體熱應(yīng)激后受精卵和2-細胞期胚胎內(nèi)谷胱甘肽水平下降，過氧化氫水平升高(分別于熱應(yīng)激后立即檢測和熱應(yīng)激后恢復(fù)12 h檢測)。相反，體外小鼠受精卵和2-細胞期胚胎遭受相同強度熱應(yīng)激后，谷胱甘肽水平和過氧化氫水平與正常培養(yǎng)組差異不顯著[4]。可能是熱應(yīng)激誘導(dǎo)母體生殖道內(nèi)環(huán)境的生理生化條件發(fā)生變化，胚胎內(nèi)氧化應(yīng)激加強，最終導(dǎo)致胚胎發(fā)育能力降低。研究已證實，熱應(yīng)激致使胚胎內(nèi)過氧化氫含量升高[5]，抗氧化劑谷胱甘肽含量降低。在培養(yǎng)液中添加抗氧化劑可以增強胚胎對熱應(yīng)激產(chǎn)生的耐受性，而抑制胚胎谷胱甘肽的合成會導(dǎo)致胚胎對熱應(yīng)激的耐受性降低。另外，與體細胞不同的是，附植前胚胎不能自發(fā)合成谷胱甘肽，其抵抗氧化應(yīng)激的能力更弱。因此，早期胚胎對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是非常敏感的，這也是高溫抑制早期胚胎發(fā)育的原因之一。

1.2促使細胞凋亡

熱應(yīng)激能誘導(dǎo)多種細胞發(fā)生凋亡，包括卵母細胞和附植前的胚胎[6-8]。熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡是胚胎發(fā)育過程中抵抗熱應(yīng)激的一種自我保護方式；熱應(yīng)激時胚胎細胞凋亡的程度還能反映出胚胎對熱應(yīng)激的敏感性。正常的細胞凋亡在哺乳動物發(fā)育過程中作為一種質(zhì)量控制機制，用于清除體內(nèi)損傷的、無功能的、異常的、錯位的細胞[9]。熱應(yīng)激嚴(yán)重損傷的細胞如果不能發(fā)生細胞凋亡，通常會引發(fā)壞死。但是，熱應(yīng)激誘導(dǎo)細胞過度凋亡也會影響到胚胎的正常發(fā)育。Roth等發(fā)現(xiàn)，40℃和41℃熱應(yīng)激的卵母細胞的TUNEL陽性率高于38.5℃組。在卵母細胞成熟培養(yǎng)基內(nèi)加入CaspasesII抑制劑后，分別在38.5℃和41℃條件下成熟和受精，當(dāng)胚胎培養(yǎng)至第8d時，CaspasesII抑制劑能阻斷熱應(yīng)激對卵裂率和囊胚率的影響。說明卵母細胞成熟期間熱應(yīng)激能促使Caspases II介導(dǎo)的細胞凋亡，而導(dǎo)致卵母細胞受精后早期胚胎發(fā)育能力下降[10]。熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡是熱應(yīng)激對早期胚胎最為常見的一種損傷之一，并且熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡不但具有發(fā)育階段特異性，還與熱應(yīng)激的強度和持續(xù)的時間密切相關(guān)。Hansen等(2004)對不同發(fā)育階段的牛胚進行不同強度熱應(yīng)激處理時發(fā)現(xiàn)，41℃熱應(yīng)激9 h和42℃熱應(yīng)激9 h對2-細胞期胚胎、4-細胞期胚胎及受精后第3 d收集的8-細胞期胚胎和16-細胞期胚胎的細胞凋亡沒有影響；40℃熱應(yīng)激80 min對受精后第4 d收集的8-細胞胚和16-細胞胚的細胞凋亡也影響不大，但41℃熱應(yīng)激9 h能夠?qū)е略摃r期胚胎細胞凋亡率增加，另外，在該階段40℃預(yù)熱應(yīng)激80 min能抑止41℃熱應(yīng)激9 h誘導(dǎo)的細胞凋亡；16-細胞期以后的胚胎經(jīng)相同熱應(yīng)激處理后，細胞凋亡數(shù)明顯增加，胚胎總細胞數(shù)也顯著降低[11]。并且，42℃熱應(yīng)激組凋亡細胞率隨著熱應(yīng)激時間的延長而增加。熱應(yīng)激不能誘導(dǎo)2-細胞期胚胎和4-細胞期胚胎發(fā)生細胞凋亡與CaspasesII活性缺乏有關(guān)。Caspases沒有活性并不表明缺乏Caspases酶原或缺乏激活Caspases的信號傳導(dǎo)通道。蛋白激酶C的抑制劑十孢子堿能誘導(dǎo)小鼠受精卵至4-細胞期胚胎和牛的受精卵至16-細胞期胚胎發(fā)生細胞凋亡[12]。另外一種可能是早期胚胎中抗細胞凋亡蛋白含量比較高，在胚胎發(fā)育過程中，這種蛋白的含量降低，以致熱應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡成為可能。將第4 d的8-細胞至16-細胞期的胚胎經(jīng)過溫和的、短暫的熱應(yīng)激(40℃熱應(yīng)激80 min)處理能阻斷后來更為嚴(yán)重的熱應(yīng)激(41℃熱應(yīng)激9 h)誘導(dǎo)的細胞凋亡。這種現(xiàn)象在其他細胞中也有發(fā)生。我們推測，適當(dāng)?shù)念A(yù)熱應(yīng)激能保護隨后強烈熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡的生化機制可能與HSP70有關(guān)[13-16]。

1.3阻礙有絲分裂

哺乳動物早期胚胎遭受熱應(yīng)激后，其囊胚率和孵出率降低，胚胎總細胞數(shù)也明顯減少，說明熱應(yīng)激抑制了胚胎細胞的進行有絲分裂和增殖。其機制可能是熱應(yīng)激破壞了細胞有絲分裂裝置，如中心體、紡錘體、細胞骨架成分等。細胞骨架成分對熱應(yīng)激非常敏感。而細胞骨架成分在細胞分裂活動中起著重要的作用。處于有絲分裂S期的體細胞遭受熱應(yīng)激后，會導(dǎo)致染色質(zhì)提前濃縮和微核形成。處于有絲分裂M期的細胞遭受熱應(yīng)激后會導(dǎo)致有絲分裂紡錘體分解，形成多倍體，胞質(zhì)分裂失敗。添加微管抑制劑[17-18]和微絲抑制劑[19]能破壞核成熟。41℃～41.5 ℃熱應(yīng)激會導(dǎo)致已成熟牛卵母細胞[20]，正在成熟的豬卵母細胞[21]及2-細胞期牛胚[22]的微絲和微管結(jié)構(gòu)改變，說明細胞骨架的破壞抑制了細胞有絲分裂的進程。另一方面可能是熱應(yīng)激導(dǎo)致細胞有絲分裂的相關(guān)細胞因子失調(diào)，如Cdc2活性降低(細胞成熟促進因子MPF的催化亞基，誘導(dǎo)細胞進入有絲分裂)，CyclinsA/B(細胞周期調(diào)節(jié)蛋白)水平升高。真核細胞分裂，包括胚胎分裂，是由MPF激酶的活動所調(diào)控，MPF激酶有兩個亞基CyclinB1和Cdc2組成。在細胞有絲分裂的G1期、S期和G2早期，Cdc2是磷酸化狀態(tài)，MPF激酶活性很低；在G2晚期，Cdc2是去磷酸化狀態(tài)，與CyclinB1結(jié)合，使得細胞周期通過M期。將小鼠受精卵暴露于熱應(yīng)激導(dǎo)致體外發(fā)育阻滯在2-細胞期。目前研究證實，發(fā)育阻滯的2-細胞期胚胎在第二個細胞周期時Cdc2很低[23]。但是，在培養(yǎng)液中添加于Cdc2活性相似的SOD或硫氧還蛋白，可以使發(fā)育阻滯的胚胎通過第二次細胞有絲分裂。第二個細胞周期G2期Cdc2的失活是2-細胞期胚胎發(fā)育阻滯的直接原因之一。

2　熱應(yīng)激誘導(dǎo)的熱休克蛋白70表達對細胞的保護作用

雖然熱應(yīng)激會對哺乳動物早期胚胎造成一定的損傷，但是胚胎本身還能對熱應(yīng)激源做出保護性應(yīng)答反應(yīng)，其中熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，Hsps)就是應(yīng)答反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一。其中Hsp70家族是附植前胚胎主要表達的保護性蛋白之一。Hsp70-2僅限于熱休克狀態(tài)表達，Hsp70B基因和Hsp70B'基因，為嚴(yán)格熱誘導(dǎo)表達，無基礎(chǔ)表達。結(jié)構(gòu)型Hsp70在植入前各期鼠胚胎中均有表達。誘導(dǎo)型的Hsp70在胚胎發(fā)育到8-細胞期胚胎時才能檢測到。Hsp68能在2-細胞期小鼠胚胎自發(fā)表達，但Hsp68的表達是暫時的，在4-細胞期時即停止表達，在囊胚期后(含囊胚期)Hsp68才能被誘導(dǎo)表達。結(jié)構(gòu)型Hsp73 通常在神經(jīng)管閉合、神經(jīng)外胚層分化和增殖過程中有較高水平的表達，位于細胞漿和細胞核內(nèi)，參與神經(jīng)元的分化。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-Regulated Protein，GRP78)和GRP75在胚胎發(fā)育階段也有表達，其中GRP75定位于小鼠18號染色體。Hansen等在2-細胞期牛胚的培養(yǎng)液里加入誘導(dǎo)型的Hsp70抗體后發(fā)現(xiàn)2-細胞期牛胚發(fā)育到囊胚的百分率明顯降低[24]。Neuer等用抗鼠Hsp70單克隆抗體與2-細胞期鼠胚共同培養(yǎng)，在受精后第5d時囊胚孵出率明顯降低，說明Hsp70抗體對鼠胚生長產(chǎn)生強抑制作用。Mirkes等發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型Hsp70的轉(zhuǎn)基因小鼠可以防御由高熱引起的胚胎致死效應(yīng)。還有很多類似的試驗證明Hsp70對胚胎發(fā)育具有保護作用。Hsp70主要從以下幾個方面保護胚胎免受熱應(yīng)激損傷。

2.1分子伴侶功能

在正常未受應(yīng)激的細胞中，Hsp70家族成員參與兩種伴侶功能。首先，Hsp70與核糖體上新生多肽結(jié)合，保證新合成蛋白正確折疊[。其次，Hsp70分子攜帶著蛋白質(zhì)，運送到不同的細胞區(qū)室，包括陪伴蛋白跨膜轉(zhuǎn)運，或通過核膜孔，還有與小泡循環(huán)中的網(wǎng)格蛋白相互作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Hsp70家族的代表性成員BiP(或GRP78)的分子伴侶功能是將蛋白轉(zhuǎn)運過網(wǎng)膜和在網(wǎng)腔內(nèi)再折疊和組裝蛋白。因此，Hsp70對調(diào)節(jié)蛋白內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。哺乳動物早期胚胎在熱應(yīng)激條件下能誘導(dǎo)合成大量的Hsp70，而其它蛋白質(zhì)的合成暫時停止或減弱。新合成的Hsp70通過在胞質(zhì)中識別和結(jié)合某些未折疊的多肽鏈，阻止其不可逆的變性和聚集，同時還促進熱變性蛋白質(zhì)的降解和清除，重新激活某些酶以維護細胞的功能和生存。熱應(yīng)激停止后，Hsp70通過ATP供能幫助折疊錯誤的蛋白質(zhì)解開，促進其正確折疊和裝配。

2.2誘導(dǎo)熱耐受性

哺乳動物細胞急性持續(xù)的暴露于高熱環(huán)境中,將導(dǎo)致細胞功能減低或喪失，最終導(dǎo)致細胞死亡；而當(dāng)這些細胞間歇性地暴露于熱環(huán)境中(其中間隔數(shù)小時生理溫度)，這些細胞將產(chǎn)生耐熱性(Thermotolerance)。在34℃下熱適應(yīng)30d的大鼠，再急性暴露于41℃1～48h，與未經(jīng)熱適應(yīng)的對照組大鼠相比發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)Hsps的基礎(chǔ)水平升高140%，其中Hsp70升高速度明顯加快，應(yīng)激后lh即達最大表達水平，而對照組則需4h才能使Hsp70 表達量達到最高水平。把雛雞每天進行短時間的熱應(yīng)激處理時發(fā)現(xiàn)，3周后細胞內(nèi)Hsp70 mRNA的表達顯著升高。將重組的誘導(dǎo)型Hsp70基因轉(zhuǎn)入鼠成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)Hsp70表達增加，成纖維細胞對熱應(yīng)激的抵抗能力增強。Browder等比較不同發(fā)育階段海膽胚胎熱應(yīng)激后的發(fā)育狀況，結(jié)果從受精卵到囊胚胎期前的任何階段都未發(fā)現(xiàn)Hsps的誘導(dǎo)合成，此期胚胎死亡及異常高達99%，但在囊胚期及其以后，熱應(yīng)激可以誘導(dǎo)Hsps合成，胚胎成活及正常發(fā)育率達99%以上。將Hsp70 mRNA注入到鼠的胚胎可以增加了胚胎對熱應(yīng)激的抵抗力。纖維原細胞顯微注射Hsp70抗體后，其對熱休克的敏感性增強，而顯微注射Hsp70 mRNA能誘導(dǎo)纖維原細胞產(chǎn)生熱耐受性。說明Hsp70能夠增加細胞對熱應(yīng)激的耐受性。因此，將胚胎經(jīng)過適當(dāng)?shù)臏睾蜔釕?yīng)激處理后，可以抵抗隨后更大強度的熱應(yīng)激，提高胚胎在各種熱環(huán)境下的存活率。

2.3抑制細胞凋亡

有研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)Hsp70水平升高能阻斷導(dǎo)致細胞凋亡的細胞內(nèi)應(yīng)激激酶(Jun N-terminal Kinase，JNK)信號通路，抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的JNK激活，從而減少細胞的凋亡。向培養(yǎng)液中加入Hsp70抗體后，胚胎細胞凋亡增多，囊胚率明顯降低[25]。Hsp70還能抑制另一種應(yīng)激激酶P38的活性，當(dāng)Hsp70家族單抗存在時，這種抑制作用則消除，P38活性升高，細胞損害嚴(yán)重。Hsp70還能阻斷細胞氧化酶C從線粒體上釋放，激活無活性的Caspases-3前體、應(yīng)激蛋白激酶和C-JUN氨基端激酶(SAPK/JNK)，干擾細胞色素C結(jié)合凋亡蛋白酶活化因子1，抑制細胞凋亡；Hsp70還可以通過防止線粒體的Bax基因上調(diào)，抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡。

2.4抵抗氧化應(yīng)激

Hsp70在細胞內(nèi)具有抗氧化的生物活性，能保護細胞抵抗應(yīng)激損傷。研究表明Hsp70可促使機體內(nèi)源性抗氧化劑(如超氧化物歧化酶，Super Oxide Dismutase，SOD)合成和釋放，還可抑制氧自由基的關(guān)鍵酶(如NADPH 氧化酶)的產(chǎn)生，通過反饋作用減少氧自由基的產(chǎn)生。Hsp70還可以減少Ca2+進入細胞，保護細胞免受由活性氧族(ROS)介導(dǎo)的Ca2+細胞內(nèi)流所引起的細胞毒性和細胞死亡。熱應(yīng)激預(yù)處理過的細胞，可以耐受H2O2對細胞膜的損傷，就是因為進入細胞的Ca2+減少。并且現(xiàn)已證實，誘導(dǎo)型Hsp70是通過提高細胞膜的蛋白轉(zhuǎn)運功能來減少細胞Ca2+內(nèi)流，達到抑制Ca2+超載的目的。

2.5參與細胞增殖

熱應(yīng)激會導(dǎo)致有絲分裂期細胞的紡錘體結(jié)構(gòu)改變，細胞有絲分裂進程被終止，或細胞進行異常分裂。但是，熱應(yīng)激一開始位于星體、紡錘體及中心體等有絲分裂裝置的Hsc70就立即釋放出來，保證細胞順利完成有絲分裂。Hsp70在細胞有絲分裂過程中起一定的作用。顯微注射Hsp70抗體能推遲熱應(yīng)激后分裂間期中心體結(jié)構(gòu)的恢復(fù)和微管的重裝配。相反，熱應(yīng)激前注射純化的Hsp70能促進熱應(yīng)激后分裂間期中心體結(jié)構(gòu)恢復(fù)和微管重裝配。向雞胚中加入微量Hsp70抗體，隨抗體濃度的增加，可破壞有絲分裂裝置，阻斷細胞分裂，干擾細胞分化。Hsp70抗體還能降低精子穿過卵母細胞透明帶的能力，干擾卵母細胞第二次減數(shù)分裂和原核的形成。在應(yīng)激情況下,Hsp70可作為細胞周期抑制分子的穩(wěn)定劑或細胞周期促進分子的抑制劑對細胞周期產(chǎn)生負性調(diào)控。

綜上所述，如果研究者能在哺乳動物早期胚胎發(fā)育的某一階段，實施適當(dāng)?shù)臒釕?yīng)激處理，以誘導(dǎo)胚胎產(chǎn)生高水平的Hsp70，可以增加胚胎對下一次熱應(yīng)激的耐受性，對提高夏季哺乳動物的繁殖性能具有一定的意義。

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The Mechanism of Heat Stress Inhibiting the Mammalian Early Embryonic Development and the Protective Effect of Hsp70

QU Ping-ping，LI Tao，HU Shi-in

(ShandongVocationalCollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，Weifang,Shandong, 261061,China)

High temperature in summer is the main reason of the degradation of mammalian reproductive performance. Heat stress inhibits the development of the early embryo by the mechanism of inducing oxidative stress, promoting cell apoptosis and blocking cell mitosis. Hsp70 plays a protective role for embryo through effect of molecular chaperones, inducing thermal tolerance, inhibiting cell apoptosis, resisting oxidative stress and engaging in cell proliferation.

heat stress; mammal; early embryo; Hsp70

2015-03-19修改日期:2015-03-25

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊建設(shè)項目(SDAIT-06-011-05)

屈平平：(1981-)，女，山東菏澤人，講師，研究方向為動物生殖生理，qupingping0929@163.c.om。

胡士林(1962-)，男，山東諸城人，教授，主要從事牛羊病研究。Email：sdmxhsl@163.com

S823

A

1001-9111(2015)05-0062-04